HPLC分离条件的优化步骤以及定量计算公式的选择-PPT.ppt

HPLC分离条件的优化步骤以及定量计算公式的选择
分离条件的优化
定量计算公式的选择
HPLC分离优化基本概念
主要内容
确定分离模式与色谱柱
1. HPLC分离优化基本概念
一、分离度与基本色谱分离方程式
1、分离度——柱的总分离效能指标
柱效参数:
标准偏差():
半峰宽(W1/2): 色谱峰高一半处的宽度W1/2 =
峰底宽(W):W=4
1. HPLC分离优化基本概念
R=,色谱图中两个相邻色谱峰达到基线分离开;
R=,表明两个相邻组分只有94%分离开。(最低指标)
分离度表达式:
R=n1/2/4•(α-1)/α•k2 ′/(1+k2 ′)
R受热力学因素[容量因子k ′和选择性系数α( α= k2 ′/ k1 ′)]和动力学因素(理论塔板数n)两个方面控制。
若相邻两峰的峰底宽近似相等,令W2=W1=W ,引入相对保留值和塔板数,分离度公式演变为下式:
柱效项
柱选择项
柱容量项
1. HPLC分离优化基本概念
2、色谱分离基本方程式
、分离模式的选择



首选C18/C8:以15cm为佳,可解决80%的样品分析,柱效应大于50000。
特殊样品用特定的柱子
不同柱子其保留性差异很大,相同条件,不同柱子比例会不一样。
不同色谱柱需合适的pH范围,-,有的色谱柱比较耐碱,kromasil可以到10,而杂化xterra在1-12,XDB在pH3-11.
容量因子和死时间的测量
在HPLC分析中,容量因子k′是一个非常重要的参数,对如何选择流动相的溶剂组成、改善多组分分离的选择性都发挥着重要的作用。
k′=t ′R/t M
t ′R = t R - t M
在HPLC分析中,死时间表示了一个在高效液相色谱固定相上未被滞留组分的保留时间。


t M = Lπr2 εT / F
式中,L为柱长,cm;r为柱内径半径,cm;F为流动相体积流速,cm3/s; εT 为总孔率,,对化学键和固定相、,。
死时间t M的测量比较困难,有以下几种方法:


t M =ΦηL2/△pd p2
式中,Φ为阻抗因子;η为流动相的动力黏度;L为柱长; △p为柱压力降;d p为固定相粒径

当dc/dp≥10 时,可按下述公式计算 t M:
t M =L / u
对全多孔固定相 u=
对非多孔固定相 u=3F/dc2