限制性内切酶酶切位点保护碱基.doc

寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。
实验方法:用γ-[32P]。取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH ), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl(视酶的具体要求而定)。20%的PAGE(7 M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
酶
寡核苷酸序列
链长
切割率%
2 hr
20 hr
Acc I

G
GG
8
10
12
0
0
0
0
0
0
Afl III
CACATGTG
CCACATGTGG
CCCACATGTGGG
8
10
12
0
>90
>90
0
>90
>90
Asc I

T
AA
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
Ava I
GGGG
GGGGG
GGGGGA
8
10
12
50
>90
>90
>90
>90
>90
BamH I
G
G
GCG
8
10
12
10
>90
>90
25
>90
>90
Bgl II
CAGATCTG
GAAGATCTTC
8
10
12
0
75
25
0
>90
>90
BssH II

T
AA
8
10
12
0
0
50
0
0
>90
BstE II
GGGT(A/T)
9
0
10
BstX I
AATGCATTGG
AATGCATTGGAA
AATGCATTGGATGCAT
22
24
27
0
25
25
0
50
>90
Cla I
CATCGATG
GATCGATC
CCATCGATGG
CCCATCGATGGG
8
8
10
12
0
0
>90
50
0
0
>90
50
EcoR I

G
GG
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
Hae III

GCT
GCAA
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
Hind III
C