cDNA文库构建策略及其分析研究进展.doc

Forpersonaluseonlyinstudyandresearch;mercialuse 自20世纪70年代中期首例cDNA克隆问世以来,构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一。cDNA便于克隆和大量表达,它不像基因组含有内含子而难于表达,因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因,并直接用于该目的基因的表达。通过构建cDNA表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源,而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针,更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。因此,cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势,从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值,是研究工作中最常使用到的基因文库。从1976年HOFSTETTER成功的构建了第一个cDNA文库以来,构建cDNA文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期cDNA文库,由于当时技术的限制,选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存等缺点,而YOUNG和DAVIS重组载体为表达性文库构建和保存提供了质的飞跃。近年来,cDNA文库构建的新方法层出不穷,但其共同目的是使cDNA文库更加迅速、高效满足研究的需要。本文就近年来发展的cDNA文库的构建及其类型特点作一简要综述。 cDNA文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDN***段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的cDNA加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括:RNA的提取(例如异硫***酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定),要构建一个高质量的cDNA文库,获得高质量的mRNA是至关重要的,所以处理mRNA样品时必须仔细小心。由于RNA酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。在获得高质量的mRNA后,用反转录酶Oligo(dT)引导下合成cDNA第1链,cDNA第2链的合成(用RNA酶H和大肠杆菌DNA聚合酶I,同时包括使用T4噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA连接酶进行的修复反应),合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体中去、分析cDNA插入片断,扩增cDNA文库、对建立的cDNA文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择,常规用的是λ噬菌体,这是因为λDNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源DNA。、简便,但文库克隆的片段一般较小,单个克隆上的DN***段太短,所能提供的基因信息很少,大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的cDNA。为了克隆到真正的cDNA全长,建立富含全长的cDNA文库具有重要意义。为此,必须克服仅用mRNA的PolyA尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长cDNA文库,是指从生物体内一套完整的mRNA分子经反转录而得到的DNA分子群体,是mRNA分子群的一个完整的拷贝。全长cDNA文库不仅能提供完整的mRN