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Western Blot (蛋白印迹技术)
实验器材和试剂:
制胶用设备(玻璃板,卡槽,梳子),电泳槽(专用),塑料挡板,3层滤纸***纤维素膜,50ml tube(配制分离胶专用),15ml tube(配制浓缩胶专用),海绵垫,塑料饭盒,剪刀,玻璃棒,镊子,干式恒温加热器,移液枪及pipette,转膜夹板,X胶片,冰盒,泡沫盒电泳缓冲液,转膜缓冲液,蛋白样品,marker,10%BSA,一抗,二抗,底物反应液(高灵敏发光试剂盒),Tris-HC(PH=),Tris-HCL(PH=),10%SDS,10%APS,TEMED,DDW,30%丙烯酰***(30% Acrylamide/Bis solution),PBS-T缓冲液,丽春红染色液,70%乙醇。
实验前准备:
1、清洗制胶用玻璃板和卡槽,晾干备用。
2、蛋白样品加入巯基乙醇和Loading Buffer并在干式恒温加热器上95°C变性3~5min。
3、剪取适当大小的***纤维素膜,放在4°C 转膜缓冲液中活化5min。
4、将滤纸和海绵垫浸泡在转膜缓冲液中湿润。
实验步骤
一、灌胶
1、将清洗干净并已晾干的玻璃板插入到制胶卡槽内,使底端平整,高的一面朝内,以便固定。
2、按照10%分离胶的配制,按体积大小依次加入到50ml tube中混匀,10%APS和TEMED最后加入,此二者为催化剂。
10%分离胶配制如下:(一块胶)9ml
30% Acrylamide/Bis
Tris-HCL PH=
10% SDS 90ul
DDW
TEMED 4ul
10% APS 90ul
Total Volume 9ml
3、将混匀的分离胶沿着玻璃板边缘加入,液面高度不超过夹板下缘(~8ml),以低于下缘2~3mm为宜,然后在液面加入70%乙醇溶液封液面,液面高度与夹板顶端齐平,等待15~20min。
4、期间配制4%浓缩胶,配法与步骤2一样,按体积大小依次加入,催化剂TEMED和10%APS最后加入:等分离胶已经凝固好要灌浓缩胶的时候加入。
4%浓缩胶配制如下:(一块胶)~3ml
30% Acrylamide/Bis
Tris-HCL PH=
10% SDS 25ul
DDW
TEMED
10% APS 50ul
Total Volume
5、取下凝固的分离胶,倒去70%乙醇,固定,晾干除去乙醇。
6、在浓缩胶中加入TEMED和10%APS,混匀,沿着玻璃板边沿灌胶,注意不要产生气泡,然后插入梳子(有字一面朝外),待其凝固5~10min,此步小心插入梳子时浓缩胶溅出进入眼睛和口腔。
7、将玻璃板小心整体取下,放入夹板中,高的一侧朝外,如果只有一块胶则在夹板另一侧放置塑料挡板,夹紧后放入电泳槽内,小心拔下梳子,里面的槽加入新鲜的电泳缓冲液,液面没过浓缩胶顶端,槽外面加入回收的电泳缓冲液。
8、依次加入3ul marker和30ul蛋白质样品,加样时小心样品溢出加样孔。
9、盖上盖子,注意正负极对应,调节电压,浓缩胶60V,20~25min;分离胶90/100V,直到溴酚蓝跑出分离胶,大约