低频细胞分选注意事项.doc

低频细胞磁珠分选注意事项:1、标本要新鲜,死细胞和碎片不应超过10%,如果死细胞过多,建议密度梯度离心提取单个核细胞。2、要有足够的细胞量,起始细胞应该尽量多。3、分选前过400目滤网(38um)。4、严格按照说明书操作,注意分选器放置方向(MACS标记正向),分选柱紧密卡入分选器中。缓冲液按照说明书配制,操作中尽量减少细胞丢失,注意选用合适的离心机和离心管,离心力按照说明书操作,300-400g,10分钟,离心管最好选用塑料尖底离心管,如BD或者Falcon公司的15ml离心管使用塑料尖底离心管。去上清时仔细操作,吸取上清时可以残留少量(残留平行细胞界面1mm水膜)。5、缓冲液润柱后加标本和缓冲液洗柱时,每次等到前一次液体快流空时再加新的液体,加样要轻,不要有气泡。6、如果过一个分选柱纯度不理想,可以再过一个新的分选柱增加纯度。7、分选后流式细胞仪检测标本最佳细胞量2X10e5以上,如果得不到,最初2例所有分选得到的细胞都用来做流式细胞仪检测,结果满意,后面的不必再做检测,一律用来做后续实验。8、流式细胞仪检测4管:分选前标本:对照管、检测管。                    分选后阴性管标本:检测                   分选后阳性管标本:检测9、流式细胞仪检测时每管之间严格冲洗,直至获取蒸馏水无细胞。PS:1细胞培养:癌症细胞多数为贴壁培养,培养时,不要铺满整个培养器皿才收集!德国技术建议不要超过80%。2收集细胞:同时加入胰酶和dna酶,可降低粘性。3一定要用滤器过滤!一定要确认死细胞的数量,超过20%,就不要做了!原则上不能高于10%4上柱前重悬:说明书上10e8的细胞用500ul重悬,此时降低细胞数量,加大重悬体积到1ml