细胞复苏、传代、冻存过程.doc

细胞培养(复苏、换液、传代、冻存)(已正)进行细胞培养前,将所用物品放入超净台中,打开紫外开关,照射20-30分钟。紫外结束后,打开鼓风,使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。:配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)(如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加):将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴,不停地晃动使其迅速溶解,大约1min。将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中,用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中,这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml,混匀,1000rpm,3分钟。然后弃掉上清,加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基,然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T25取出,拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入37℃5%CO2的孵箱内。(将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴,不停地晃动使其迅速溶解。1000rpm,离心3分钟。弃掉上清,然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。此时将其转移到T25瓶内,再加入4ml配好的培养基,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T25取出,拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入37℃5%CO2的孵箱内。):复苏的细胞在37℃5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液,去除未贴壁的死细胞(贴壁生长的细胞)。贴壁生长的细胞具体过程如下:将原培养基弃去,然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次,每次3-5ml,最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS,小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基,喷上75%的乙醇,放入37℃5%CO2的孵箱内。悬浮生长的细胞具体过程如下:将培养瓶内的培养液混匀,用1ml无菌的大枪头将培养液小心的转移至15ml无菌的离心管中,1000rpm,3分钟去上清,加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基,然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T25取出,拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入37℃5%CO2的孵箱内。:当细胞生长到80%-90%时,其的生长状态和细胞形态都比较好时,即只要判断细胞处于生长对数期,这时就可以进行细胞传代了。贴壁生长的细胞具体过程如下:将原培养基弃去,然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次,每次3-5ml,最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS,%胰酶消化,放入孵箱,1-2分钟后取出,在倒置显微镜下观察细胞形态变化,如果观察到细胞开始由长梭形变成圆球形时,喷上75%的乙醇,拿到超净台里,加入2ml培养基终止消化,用1ml无菌的大枪头或无菌的塑料吸管反复吹打,尽量使更多的细胞掉下来,吹打数次后转入15ml无菌的离心管,1000rpm,3分钟,然后弃去上清,一般细胞的传代比例为1传2或者1传3,如果要是1传2就用2ml新鲜培养基重悬,分