医学微生物实验 - 实验七.ppt

实验七质粒 DNA 提取
病原生物学系:张晓艳
R质粒接合传递试验
供体菌:福氏痢疾杆菌
耐链霉素、***霉素、四环素和磺***药物
受体菌:大肠杆菌
耐利福平
培养基:中国兰平板
100µg/ml利福平;20µg/ml***霉素
接合的机制
供
受
供
受
供
受
验证
耐药性状改变
提取质粒
供体菌
受体菌
接合后的受体菌
质粒小提试剂盒
原理(碱变性法)
基于染色体DNA与质粒的变性与复性的差异而达到分离。
,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开变性,质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物一起沉淀下来而被除去。
平衡吸附柱(已做)
取一干净的EP管,加入250µl溶液P1
(已加入RNaseA)
培养皿上刮取一接种环细菌,溶于EP管的P1液中,用移液器彻底悬浮细菌
接着加入250µl溶液P2,温和颠倒混匀4-6次,使菌体充分裂解,至菌液变清(时间不得超过5min)
再加入350µl溶液P3,立即温和颠倒6-8次,充分混匀至出现絮状沉淀
步骤
12000rpm离心10 min
将吸附柱放入收集管中,将上清移入吸附柱内(约750µl),室温放置1min,12000rpm离心1 min
倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中
加入500µl漂洗液PW,12000rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。重复该步骤一次。
步骤
吸附柱放回收集管中12000rpm离心2 min
将吸附柱放入一干净的Ep 管中,开盖,室温放置2 min
在吸附膜中央加入30µl 70℃预热洗脱缓冲液EB,室温静置1 min,12000rpm离心2 min,收集洗脱产物
重复步骤12,即,将收集的洗脱产物再加入吸附膜中央,室温静置1 min,12000rpm离心2 min,收集洗脱产物于EP管中
-20℃贮存,待检
步骤