哺乳动物表达系统.ppt

基因工程523416789基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程第1页/共42页D高等哺乳动物的基因转移8哺乳动物基因工程C高等哺乳动物的载体系统B高等哺乳动物的受体系统A高等哺乳动物基因工程的基本概念E利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白第2页/共42页A高等哺乳动物基因工程的基本概念8哺乳动物基因工程高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物细胞基因表达技术高等哺乳动物转基因技术转基因动物个体动物工程细胞哺乳动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型人体基因治疗蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型第3页/共42页B高等哺乳动物的受体系统8哺乳动物基因工程高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的遗传标记常用的高等哺乳动物受体细胞第4页/共42页高等哺乳动物细胞的生长特性正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征:锚地依赖性:细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂血清依赖性:细胞必须具有生长因子才能生长接触抑制性:细胞与细胞接触后,生长便受到抑制形态依赖性:细胞称扁平状,并有长纤维网状结构上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中,一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长,即单层细胞生长。有时,正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点,继续增殖并无限制分裂,这种状态称为细胞系形成,此时的细胞成为细胞系。第5页/共42页高等哺乳动物受体细胞的条件以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件细胞系特征丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征,便于大遗传稳定性外源基因多次传代后不至于丢失,易于长期保存合适的标记便于转化株的筛选和维持生长快且齐分裂周期短,生长均一,便于控制规模培养大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件,癌细胞能安全性能好不合成分泌致病物质,不致癌满足上述前四项要求,但在安全性能上有欠缺。第6页/共42页高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)次黄嘌呤核苷一磷酸(HMP)次黄嘌呤核苷(HR)GMPAMP尿嘧啶核苷一磷酸(UMP)胸腺嘧啶核苷一磷酸(TMP)胸腺嘧啶核苷(TR)嘌呤核苷酸生物合成途径嘧啶核苷酸生物合成途径次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)(TK)胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤(AP)氨基喋呤(AP)从头合成途径补救合成途径第7页/共42页高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞含有胸腺嘧啶核苷激酶(TK)编码基因缺陷的受体细胞(tk-)不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上(HAT培养基)生长,载体上的标记基因tk能与之遗传互补含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)编码基因缺陷的受体细胞不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上(HAT培养基)生长,载体上的标记基因hprt与之遗传互补(hprt-)第8页/共42页高等哺乳动物受体细胞的遗传标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH- 氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活G418DHFR 二氢叶酸还原酶氨甲喋呤 DHFR变体抗氨甲喋呤HPH- 潮霉素B磷酸转移酶潮霉素B HPH灭活潮霉素BTK- 胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤 TK合成TMPXGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 XGPRT合成GMPADA- 腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木***糖苷ADA灭活Xyl-A第9页/共42页常用的高等哺乳动物受体细胞迄今为止,用于医疗用品(药物、抗体、诊断试剂)大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞(CHO),其优势有如下几个方面:遗传背景清楚,生理代谢稳定与人的亲缘关系接近,外源蛋白修饰准确基因转移和载体表达系统完善耐受剪切力,便于大规模培养被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞(GRAS)第10页/共42页