抗性淀粉及总淀粉测定方法.doc

蚇抗性淀粉及总淀粉测定方法蚄采用Megazyme抗性淀粉试剂盒法,测定方法见试剂盒说明书(下附)羀原理(;法32-40)芀抗性淀粉的测定方法:样品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶(AMG)37℃振荡水浴孵育16小时,在这期间,通过两种酶的联合作用,非抗性淀粉被溶解,水解成D-葡萄糖,孵育结束后,加入等体积的乙醇或工业甲基化酒精(IMS,变性乙醇)终止反应。离心上述溶液,收集上清勿弃,底部残留絮状团即为样品中的RS,用含水的IMS或乙醇(50%v/v)洗涤絮状团,洗涤后离心,再重复一次洗涤离心,收集离心后获得的上清,与之前收集的上清混合。小心倒出试管残留的液体,将絮状团置于冰水浴中,加入2MKOH溶解,溶解的同时用磁力搅拌机剧烈搅拌。用醋酸盐缓冲液将这个溶液调至中性,用AMG将淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂(GOPOD)测定,这也是对样品中RS含量的测定。非抗性淀粉(可溶性淀粉)的测定可通过集中的上清液并定容至100mL,再用GOPOD测定D-葡萄糖完成。蒄总淀粉测定方法:即抗性淀粉与非抗性淀粉总和。螂抗性淀粉检测试剂盒荿K-RSTAR羀(100次分析)薅应用性和精确性膅这个方法需要样品中RS含量多于2%w/w。如RS含量多于2%w/w,常规标准误差为±5%。少于2%w/wRS的误差更高。肂试剂盒蒆瓶子1:淀粉葡糖苷酶AMG,12mL,3300U/mL,,40℃下,底物为可溶性淀粉,[单位或为200U/mL,,40℃下,底物为对硝基苯基β-麦芽糖苷]。AMG溶液应完全没有可检测到的游离D-葡萄糖。4℃下稳定性>3年。薇瓶子2:α-胰淀粉酶(胰酶,10g,3CeralphaU/mg)。4℃下稳定性>3年。芃瓶子3:GOPOD试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液(1M,),对羟基苯甲酸()和叠氮化钠(%W/V)。4℃下稳定性>3年。蒂瓶子4:GOPOD试剂酶。葡糖氧化酶(>12,000U)加上过氧化物酶(>650U)和4-氨基安替比林(80mg)。冻干粉,-20℃下稳定性>5年。膇瓶子5:D-葡萄糖标准溶液(5mL,)%(w/v)。室温下稳定性>5年。莄瓶子6:抗性淀粉对照。抗性淀粉含量如表所示。室温下稳定性>5年。莁溶液/(AMG;溶液1)。这个溶液是有粘性的,因此应使用正向移液器移取分装。4℃下稳定性>3年。羇稀释AMG(300U/mL)。(,;试剂1,非提供)稀释至22mL。以5mL为单位分装后用聚丙烯管冷冻保存。反复冻融不会影响稳定性,稳定性-20℃>5年。(100mM,;试剂1,非提供)悬浮1g瓶子2中的产品(α-胰淀粉酶),搅拌5分钟。(300U/mL),混匀。>1500g离心10分钟,慢慢倒出上清液,这就是制备的溶液2。溶液2制备后应当天使用。(GOPOD试剂缓冲液)稀释至1L,这就是制备的溶液3。制备后马上使用。蚈备注:蒇(1)如果浓缩缓冲液在-20℃下储存,它将形成结晶盐,因此必须要完全溶解才可以用蒸馏水稀释。袂(2)%(w/v)的叠氮化钠。因此这是个有毒化学物,应进行相应的处理。,定量转移这个溶液至装有剩余溶液3的瓶子中。用铝箔封盖瓶子以遮光。这就是葡萄糖测定试剂(GOPOD试剂),可以在2-5℃保存3个月或者-20℃下保存一年。蒈如果试剂要以冷冻态储存,应分装后再冻存。芄当试剂是新鲜制备的,它的颜色应是浅黄色或浅粉色。在4℃储存2-3个月时会演变成深粉色。当以蒸馏水为对照时,。芅5&。室温下稳定性>5年。腿没有提供的试剂(应购买分析纯级)(马来酸钠)缓冲液(100mM,)加上5mM二水氯化钙和叠氮化钠(%w/v).,用4M(160g/L),,并溶解。定容至2L。4℃下可保存一年。(,)()加至800mL的蒸馏水中,。用蒸馏水定容至1L,室温下可保存一年。(100mM,),用4M氢氧化钠调节pH至4