Sars-CovMNS蛋白的表达和细胞定位.doc

Sars-CovMNS蛋白的表达和细胞定位.DOCSars-CovM,N,S蛋白的表达和细胞定位生命科学学院00级陆文摘要在获得Sars-Cov的结构蛋白S,M,N的cDNA的T-Easy克隆之后,通过限制性内切酶处理后连接到表达载体上,然后通过bac-to-bac杆状病毒表达系统,把结构蛋白的DNA转座到bacmid中,转染昆虫细胞,包装出第一代病毒后,用重组病毒感染昆虫细胞,从细胞中纯化到Sars-,,免疫荧光制片,,将克隆到荧光蛋白载体的M,N,蛋白和真核表达载体的S蛋白转染真核细胞,通过荧光蛋白的分布或免疫荧光确定M,N,:Sars-Cov,Sars-Cov结构蛋白,M,N,S蛋白,转染,westernblotting,免疫荧光。前言冠状病毒科的成员只感染脊椎动物,与多种动物和人的疾病有关,本科病毒具有胃肠道,呼吸道和神经系统嗜性,,略成球形,直径80-,在脂质双层中穿插有两种糖蛋白:膜蛋白(M,又称E1)和纤突蛋白S(又称E2).囊膜表面覆有长12-24nm的突起(即纤突),纤突末端呈球状,由于囊膜纤突规则的排列呈皇冠状,(N)组成的核蛋白核心,呈螺旋式结构,直径9-:M蛋白(20-30KD)是一种转膜糖蛋白,它通过3个疏水α-螺旋区3次插入脂质双层,故其大部分(85%)位于囊膜内部,,副粘病毒以及弹状病毒的非糖基化蛋白,在病毒装配期间将核衣壳连接到囊膜上,另外,(180-200KD)大部分暴露在脂质层外面,,S蛋白能直接与宿主细胞表面的受体结合,引起细胞融合,,基因组大小为27-30KB,,5’末端具有帽结构,3’’末端的非编码区和负股5’,基因组RNA5’末端序列与不同mRNA基因之间的序列有高度的同源性,都有UAAAC序列,在先导RNA序列与基因内部起始位点之间有7-18个核苷酸是相同的,这些序列的特点与冠状病毒的先导-,冠状病毒基因组RNA具有很高的重组率,这一现象类似分节段的RNA病毒,,:一为细胞对病毒的吞饮,,于胞浆内发生脱壳,随后正链基因组RNA活化,呈现mRNA的作用,首先指导早期翻译病毒特异性RNA聚合酶,,由负链RNA转录出正链RNA和许多编码病毒蛋白的mRNA,他们具有相同的3’末端和65个核苷酸的5’端先导序列,分别编码结构蛋白M,S,N和非结构蛋白(NS).核衣壳的装配发生在胞浆的病毒工厂(毒浆)内,,,(severeacuterespiratorysyndrome)病毒是一种新的冠状病毒,全基因组由29,727个核苷酸组成,具有11个开放阅读框,基因组结构与其它冠状病毒相似,(CDS,codingsequence),序列比对的结果显示从第250位核苷酸开始编码的,长度为7074个氨基酸的多肽预测的开放读码框1ab多聚蛋白,和鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirus,MHV)的相应片断很相似,根据已有的鼠肝炎病毒相应片断的知识,将预测的开放读码框1ab多聚蛋白又分成14个蛋白,(开放读码框1a多聚蛋白),,分别对应于S蛋白、M蛋白、E