高纯度质粒小提中量试剂盒说明书-天根.doc

柱平衡步骤:向吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL,12000rpm(~13400g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)取5-15ml过夜培养的菌液加入离心管中,12000rpm(~13400g)离心1min,尽量吸除上清。注意:菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中,菌体量以能够充分裂解为佳,过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液Pl(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意:请务必彻底悬浮细菌沉淀,如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。质粒向离心管中加入500μL溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意:温和地混合不要剧烈震荡,以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠,所用时间不应超过5min,以免质粒受到破坏。如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。向离心管中加入700μL溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm(~13400g)离心10min,此时在离心管底部形成沉淀。注意:P3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。将上一步收集的上清液分次加入过滤柱Cs(过滤柱放入收集管中),12000rpm(~13400g)离心2min,小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中),(如果过滤柱中有残余的液体说明步骤5吸取的上清中杂质过多,可以延长离心的时间;)。12000rpm(~13400g)离心lmin,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP4放入收集管中。向吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD,12000rpm(~13400g)离心lmin,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP4放入收集管中。向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm(~13400g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP4放入收集管中。注意:加入漂洗液PW后,如果室温静置2-5min,有助于更好地去除杂质。向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW,12000rpm(13400g)离心lmin,倒掉收集管中的废液。将吸附柱CP4重新放回收集管中置于12000rpm(~13400g)离心2min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意:漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱CP4开盖,