人胎儿角膜上皮细胞体外培养和性质鉴定.pdf

摘要目的建立人胎儿角膜上皮细胞体外原代培养和传代培养方法,优化人胎儿角膜上皮细胞的培养体系,为构建组织工程角膜提供上皮种子细胞。方法一、人胎儿角膜上皮原代和传代培养⒃嘌严格无菌操作获取人胎儿角膜片,采用组织块贴壁法悄ぴ挡俊⒅醒氩、酶消化法原代培养人胎儿角膜上皮细胞。⒋ù嘌角膜缘部的细胞生长融合达%以上,不同稀释浓度的胰酶/消化液消化传代分别接种于空板、小鼠上宋赴茄恪⑻ザ悄せ氏赴茄慵癏饲养层,培养液分别采用疐、小鼠上宋赴跫嘌骸⑻ザ悄せ细胞条件培养液、跫嘌骸二、人胎儿角膜上皮细胞培养体系的条件优化⑷痔跫嘌旱鞍缀坎舛ㄓ胂赴鲋臣觳将收集的小鼠上宋赴跫嘌骸⑻ザ悄せ氏赴跫嘌骸条件培养液使用鞍锥渴约梁胁舛ㄑ返牡鞍缀俊设疐为对照组,ḿ觳条件培养液、胎儿角膜基质细胞条件培养液、跫嘌憾匀私悄ど掀は赴档脑鲋衬芰Α⑴=悄は赴扑橐旱鞍缀坎舛ㄓ胂赴鲋臣觳将收集的牛角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞三种细胞破碎液原液使用蛋白定量试剂盒测定样品的蛋白含量。设疐为对照组,ḿ觳夂%、、不同浓度的三种牛角膜细胞破碎液对人角膜上皮细胞系的增殖能力。三、人胎儿角膜上皮细胞的性质鉴定将代人胎儿角膜上皮细胞用/抗体进行荧光染色,观察传代细胞是否还保持有角膜上皮细胞的特性。收集代人胎儿角膜上皮细胞总媒悄せ氏赴魑R跣远哉眨觳釱、、和趍缴系谋泶锴榭觥一、人胎儿角膜上皮细胞的生长情况观察结果
⒃嘌角膜缘部组织块周围迁出的细胞以圆形或卵圆形为主,排列紧密,生长状态良好;中央部的角膜上皮细胞体积大,以大而扁平的类表层上皮细胞为主,生长状态差;消化法培养可观察到上皮消化成单细胞悬液,但接种后无细胞贴壁。⑾赴ù观察不同浓度消化液消化传代的细胞发现,采用ヒ让甘.%消化可观察到消化后的细胞大部分成单细胞状态,传代培养后细胞贴壁及增殖良好。接于茄愫吞ザ悄せ氏赴茄闵系南赴灰滋谇蚁赴辉鲋常接于茄闵系南赴寺∩ぃ鲋衬芰η浚ḿ绦ù笙赴匣辉僭殖,容易有角膜基质细胞污染。采用疐、跫嘌杭疤ザ悄せ氏赴跫嘌号嘌赴鲋衬力弱,逐渐老化,不能继续传代;采用跫嘌号嘌嘌天后,可见形态规则的卵圆形小细胞集落分布于不规则的大细胞间,细胞增殖能力强。传至代胎儿角膜上皮细胞仍有较强增殖能力,但小细胞明显减少。二、人胎儿角膜上皮细胞培养体系的条件优化⑷痔跫嘌憾匀私悄ど掀は赴鲋车挠跋用鞍锥渴约梁卸条件培养液、胎儿角膜基质细胞条件培养液、条件培养液进行蛋白含量测定,结果显示跫嘌鹤榈鞍缀孔罡摺ḿ觳饨峁允条件培养液可明显促进的增殖,其与胎儿角膜基质细胞条件培养液、跫嘌汉虳/椴钜炀邢灾耐臣蒲б庖濉⑷峙=悄は赴扑橐憾匀私悄ど掀は赴鲋车挠跋用鞍锥渴约梁卸耘=悄ど掀ぁ⒒始澳谄は赴扑橐阂禾褰械白院量测定,结果显示牛角膜上皮细胞破碎液为./,牛角膜基质细胞破碎液为./,牛内皮细胞破碎细胞液为ḿ觳饨峁允%的牛上皮细胞破碎液、ヅ;氏赴扑橐骸牛内皮细胞破碎液均可明显促进的增殖,四组与疐之间差异有显著的统计学意义,四组问差异无统计学意义。三、人胎儿角膜上皮细胞的性质鉴定⒚庖哂ü馊旧ǹ杉鸓娜颂ザ悄ど掀は赴鸎旧粜浴狿检测显示,代人胎儿角膜上皮细胞在水平上有、、虯的高表达,而角膜基质细胞表达较弱。结论一、组织块贴壁法原代培养人胎儿角膜上皮细胞以及小鼠上宋赴跫嘌痬
关键词:胎儿角膜上皮细胞;体外培养;增殖;条件培养液;牛角膜内硕士研究生高美丽劭蒲指导教师史伟云教授皮破碎液二、人胎儿角膜缘部上皮细胞增殖能力优于中央部;三、赴跫嘌耗艽俳悄ど掀は赴脑鲋场液传代培养方法基本建立;
二、,甌./——、,.,痬痬%琧妫琣,../
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人胎儿角膜上皮细胞的体外培养和性质鉴定引言角膜病盲是我国的第二大致盲眼病,角膜移植是复明唯一有效的治疗手段。据统计全