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菌落的PCR鉴定.doc

文档分类：医学/心理学 | 页数：约2页举报非法文档有奖

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实验六菌落的PCR鉴定【实验目的】通过本实验学****菌落PCR的基本原理与实验技术。【实验原理】重组子经过蓝白斑筛选后(具有假阳性),接下来可通过菌落PCR方法对重组子进一步进行快速鉴定。以重组质粒作为PCR扩增模板。采用外源基因特异性引物进行扩增,如果重组质粒转化入宿主细胞,则可以扩增得到预期大小的目的片段。【实验步骤】用200μL的黄色枪头挑取转化平板上白色的单菌落于15μL无菌水中,吹打混匀,从中取2μL菌液作为菌落PCR模板。:反应物体积/(ddH2O)×()(2μM)(2μM)()。加样后用手轻弹混匀,6,000rpm离心15sec使反应成分集于管底。:①94℃预变性3min;②94℃变性30sec;③64℃退火30sec;30cycles④72℃延伸1min;⑤72℃延伸3min;⑥16℃pause反应结束后短暂离心,置4℃保存备用。配制1%的琼脂糖凝胶。×loadingbuffer于1%的琼脂糖凝进行电泳剩余的13μL菌液置4℃保存备用。【结果与分析】3214本实验扩增片段长652bp。由图可知,1、4泳道没有条带,说明目的基因没转入感受态细胞。可能的原因是连接体系有外源性核酸酶污染,使T-载体变为平端,连接后由于移码,而生成白斑。而2、3号泳道目的基因已成功转入感受态细胞中,所得片段大小符合目的片段。

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