胶体金免疫标记技术.doc

一、胶体金的制备根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nm的胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在3-30nm范围内。在***化金(HAuCl4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂,可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,***化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的1/8。以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3~16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄,而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。~%的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10nm的胶体金时建议使用该方法。利用柠檬酸为还原剂,可以制备12~150nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时,胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备12-16nm直径的胶体金。除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备5nm的胶体金,它避免了单宁酸残基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理,故该方法已经很少使用。***化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(),因此在配制***化金溶液时一次配完,(-20℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双***硅烷/***仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水,。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。制备好的胶体金保存寿命较长,可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3~16nm胶体金取一250ml三角瓶,加入79ml双蒸水和1ml1%***化金,预热至60~70℃。取一50ml烧杯,加入4ml1%柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的25mMK2CO3。预热至60~70℃。K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。,对pH的影响不大,K2CO3可以省略。将上两种溶液迅速混合并充分混匀,加热至沸并保温10分钟。自然冷却。柠檬酸钠(ml)单宁酸(ml)胶体金(nm)450003420004450064120847010410162、白磷还原法制备5nm胶体金取250ml三角瓶一个,加79ml双蒸水,1ml1%***化金,()。/***,***,混匀。(1)中(磷有毒且易燃,操作请带手套,多余的磷溶液用CuSO4进行中和)。室温下轻轻摇匀15min,然后加热沸腾并保持5min,自然冷却。3、柠檬酸三钠法制备12-30nm胶体金(Frens,1973)取250ml三角瓶一个,加100ml双蒸水及1ml1%***化金,加热沸腾;柠檬酸钠(ml)胶体金(nm)%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀,再保持沸腾30min,溶液颜色首先变黑,再逐渐变红,粒子体积较小时,溶液呈桔红色,而粒子体积较大时,则颜色偏向紫色。注意:由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差,以及制备过程中的其它问题,胶体金粒子的大小及一致性与理论值可能有偏差,因此,在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大,粒子凝聚,粒子边缘不清晰等问题,须重新制备。胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中;也可保存在室温下,一般可保存1-2个月。但决不可保存在0℃以下,否则金粒子发生凝聚。二、蛋白-金复合体的制备一般认为胶体金粒子表面为一层AuCl2,因此,粒子表面带有负电荷,这种负电荷粒子之间相互排斥,形成稳定悬浮的胶体金溶液。金颗粒表面可以包被一层生物大分子(如蛋白)来稳定和保护这些粒子,以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于pH值,这是因蛋白的净电荷取决于溶液的pH值,在pH=pI时为中性。由于在pH=pI时蛋白溶解度最小,因此这时它水化程度最小,最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备中,一般胶体金调整为pH=PI+,这样蛋白带正电,有利于结合更稳定。胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理,其目的在于(1)去除高浓度的盐分,高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合,或导致胶体金粒子的凝聚,这一步往往采用低浓