6—羟基多巴胺损伤早期帕金森病大鼠模型实验探究.docx

6—羟基多巴胺损伤早期帕金森病大鼠模型实验探究.docx6—轻基多巴***损伤早期帕金森病大鼠模型实验探究摘要:目的观察6-轻基多巴***(6-hydroxydopamine,6-0HDA)损伤早期帕金森病(Parkinson1sdisease,PD)大鼠行为学及黑质部位组织学的变化特点。方法偏侧前脑内侧束注射6-0HDA,通过阿扑吗啡诱发旋转试验、跨步调节试验和姿势部对称试验评估注射后24h、7d及28d大鼠行为学的变化;通过免疫组织化学染色观察黑质部位酪氨酸轻化酶(tyrosinehydroxylase,TH)阳性细胞计数的变化。结果6-0HDA组大鼠跨步调节试验评分减少,姿势不对称试验评分增加,阿扑吗啡诱发大鼠向损伤对侧旋转,与对照组和假手术组比较统计学差异显著(P210次/30min为合格模型。、固定、取材、切片各组大鼠在最后一次行为学检测后,用复合麻醉剂麻醉,剪开大鼠胸腔,经主动脉快速灌注生理盐水(371)150〜200mL冲洗,至大鼠肝脏发白,流出液基本无色为止。随即灌注4%甲醛(4°C)先快速灌注200mL,再缓慢灌注300mL,至头与四肢均已发硬。断头取脑,置于4%甲醛,放4*冰箱固定4h,再依次置入20%及30%蔗糖磷酸盐缓冲液内,存41冰箱至脑块沉入瓶底。取中脑黑质组织块进行冠状连续冰冻切片,,具体步骤依次为:()磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次,5min/次。%H2O2抑制内源性过氧化物酶活性,(95°C)复性(2min),非免疫的正常羊血清,室温下孵育30min,抗TH抗体(1:1000,抗体稀释液稀释),37°C孵育4h,SABC试剂,室温下孵育lh,DAB显色(阳性产物为棕黄色)。()PBS漂洗3次,5min/次,正常羊血清与抗TH抗体孵育之间不漂洗。显色后贴片,自然风干,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。 ,在X100倍显微镜下计数两侧黑质有完整细胞体的TH阳性细胞,计算左侧与右侧黑质TH阳性细胞数的百分比(左侧黑质TH阳性细胞数/右侧黑质TH阳性细胞数X100%)o参照蔡文琴等[5]介绍的神经细胞计数方法进行细胞计数。。数据资料采用均数土标准差(x±s)表示。单因素方差分析进行差异性检验,P210次/30min,对照组及假手术组大鼠未诱发出旋转行为,见表3。2组织学检测抗TH染色结果显示,在左侧前脑内侧束注射6-0IIDA后24h,大鼠左侧黑质TH阳性神经元数目出现有意义减少,高倍镜下见少部分神经元出现胞体肿胀、核膜界限消失等变性征象,部分神经轴突断裂、错乱;7d和28d时大鼠左侧黑质TH阳性神经元几乎消失,残留的TH神经元表现出染色质浓缩坏死现象,神经轴突散在稀疏;模型组大鼠右侧黑质TH阳性神经元数目同时也有部分减少;对照组及假手术组大鼠两侧黑质TH阳性神经元无明显改变,见表4,图lo3讨论研究PD需要建立稳定可靠的模型。6-0HDA是一种选择性中枢儿茶酚***能神经元毒性物质,具有很强的呼吸链抑制作用,偏侧6-0HDA损毁模型是目前使用最多的PD模