河南大学医学院试验教案-生物化学与分子生物学教研室.doc

河南大学医学院实验课教案首页实验名称用重组质粒DNA转化大肠杆菌授课对象04级药学2班教学目标学时分配大体内容与时间安排:(6学时)掌握***化钙转化法将重组质粒DNA导入大肠杆菌的原理,及在生物工程中的作用。讲授时间30分钟掌握转化和转染的概念并了解几种转化的方法。讲授时间10分钟学会感受态细胞的制备及其转化大肠杆菌的操作过程讲授时间20分钟学生操作时间240分钟授课重点***化钙转化法将重组质粒DNA导入大肠杆菌的原理感受态细胞的制备及其转化大肠杆菌的操作过程授课方法课前准备讲授为主,结合提问、总结,指导纠正教材《生物化学实验指导》刘玉庆主编人民卫生出版社教研室审查意见主任签字授课教师姓名及职称:日期:河南大学医学院实验课教案实验名称用重组质粒DNA转化大肠杆菌实验目的用***化钙转化法将重组质粒DNA导入大肠杆菌,并用含氨苄的LB固体培养基鉴定。实验原理转化目的是把有复制能力,但在细胞外无复制活性的目的基因-载体重组体装入受体细胞(大肠杆菌),使目的基因随载体在细胞内复制、扩增。***化钙转化法,是采用CaCl2处理大肠杆菌细胞,提高其细胞膜的透性,制备成感受态细胞。然后用热击的方法,严格控制温度和作用时间,将重组质粒DNA导入大肠杆菌细胞,并用含氨苄的LB固体培养基鉴定转化结果,已转化的菌体可形成菌落(因质粒上有抗氨芐青霉素基因)。本试验,需用未经转化的感受态大肠杆菌细胞作阴性对照;同时用质粒PUC19转化的感受态大肠杆菌细胞作阳性对照。基本操作仪器介绍基本操作:接种、高速离心、冰浴、热击、恒温摇床培养、涂布、细菌在固体培养基倒置培养。仪器:恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,微量移液枪,eppendorf管。实验步骤一、,接种于3-5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37℃振荡培养2-4小时至OD600=。二、感受态细胞的制备(CaCl2法) 1、,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。(从这一步开始,所有操作均在冰上进行,速度尽量快而稳) 2、弃去上清,,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 3、弃去上清,加入600µ,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 4、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验,也可加入占总体积15%左右高压灭菌过的甘油,贮存于-70℃可保存半年。三、 1、分别取3个100µl感受态细胞悬液,第一组为转化实验组:10µl重组质粒DNA+100µl感受态细胞;第二组为阴性对照组:完全不加质粒DNA的100µl感受态细胞悬液;第三组为质粒DNA对照组,即1ng未酶切的