M5 HiPer pTOPO-TA Simple.doc


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M5HiPerpTOPO-TASimpleCloningKit使用说明书产品名称单位货号M5HiPerpTOPO-TASimpleCloningKit20TMF020-01M5HiPerpTOPO-TASimpleCloningKit4×20TMF020-04【储存条件】长期保存,请置于-20˚C,有效期12个月。使用后请及时放入-20˚C保存以保证酶的活性。【产品简介】本制品和传统的T4连接酶原理不同,它利用了Topoisomerase可以在瞬间(几秒钟-几分钟)、高效(接近100%)连接DN***段的原理采用本公司独创的工艺制成。本制品在克隆插入位点两侧不含多克隆酶切位点,需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行DNA酶切时,酶切反应将不会受到T载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响,可以大大提高酶切效率,增加亚克隆成功率。【产品特点】(几秒钟-几分钟)完成连接。,室温5分钟内完成转化;无需1小时复苏,只需37˚C10分钟复苏便可以涂板。从连接到涂板只需15-20分钟。、零背景,无需繁琐蓝白斑筛选,见到长出的克隆便是有插入的(接近100%)。。(见后面图谱)【产品组份】20T4x20TM5HiperpTOPO-TASimpleVector(30ng/µl)20µl80µl1000bpControl(30ng/µl) 5µl5µl10xEnhancer 20µl80µl【操作步骤】:<注意:PCR引物不能磷酸化>。使用能在PCR产物末端加一个突出的3’-A的酶系列扩增(如Taq、TaqHiFi、Tth、AmpliTaq、KlenTaqDNAPolymerase)。PCR产物(仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体)可直接进行连接反应,无需纯化;如果有非特异扩增,建议胶回收纯化(货号:MF029)。如果是以质粒为模板的PCR产物,也必须进行切胶纯化,因为模板质粒也可能长出菌落(但不是想构建的目的载体)。:1)室温(20˚C-30˚C)下建立如下体系(10µl体系):纯化后的PCR产物/或者1µ-8µlM5HiperpTOPO-TASimpleVector1µl10xEnhancer1µl灭菌水补齐到10µl<注意:如果使用5µl体系,各成分按照比例减半,使用次数可以加倍>。加完试剂后,用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀,低速瞬时离心收集所有液体在离心管底。<注意此步骤不能在冰上进行,只能在室温(20℃-30℃)进行>。不同大小插入片段的推荐用量:插入片段大小(bp) 最佳用量(ng)100-100020-501000-2000 50-1002000-5000 100-2002)室温(20˚C-30˚C)连接5分钟。<推荐室温5分钟完成连接,但在很多情况下连接2-3分钟已经可以得到足够多的转化子>。3)连接产物可直接转化感受态细胞或贮存于-20˚C。<如尚未准备好感受态细胞,可以将连接产物短时间置于冰上备用>。:1)50-100µl感受态细胞,置于室温解冻,完全解冻后(约1分钟左右)轻掸几次将细胞均匀悬浮。2)加入5µl

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  • 时间2019-07-14