生物素－亲和素.ppt

生物素-亲和素标记技术食安0501类春燕孙隽陈春艳孙晓丽李臻佳是生物体内广泛分布的一种羧化酶的辅酶,分子中有两个环状结构:Ⅰ环为咪唑***环,是与亲和素结合的主要部位。Ⅱ环为噻唑环,上有一戊酸侧链,其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子(如:酶、蛋白质、抗体、DNA)的唯一结构。生物素(Biotin)-辅酶R、维生素H利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性生物素,以适合与各种生物大分子结合的需要。主要有用于标记蛋白质氨基的生物素N-羟基丁二酰亚***酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯(pBNP),其中以BNHS最为常用。近年来,应用长臂生物素(BCNHS)标记生物大分子,可以减少位阻效应,增加检测的灵敏度和特异性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生物有生物素酰肼(BHZ)及肼化生物素(BCHZ)。亲和素(Avidin)-抗生物素蛋白、抗生物素是从鸡蛋清中提取的一种糖蛋白,它由四个相同的氨基酸亚基组成,亚基之间通过二硫键连接,亲和素的每一个亚基含有一个与生物素结合的位点,并与生物素或其衍生物形成高度稳定的复合物。基本原理生物素与抗体共价交联的方法简单,条件温和,且一般不影响抗体的活性。生物素与亲和素能快速结合,而且反应不受外界干扰,具有高度特异性和稳定性,两者的亲和常数比抗原-抗体反应高10-100万倍,结合快,呈不可逆反应,而且在pH,温度、有机溶剂或变性剂较大的变化范围内均能稳定存在。生物素-亲和素系统(BAS)用于检测的基本方法有三类:标记亲和素连接生物素化大分子反应体系,称BA法,或标记亲和素-生物素法(LBA)。以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素,称为BAB法,或桥联亲和素-生物素法(BRBA)。将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物,再与生物素化的抗抗体接触时,将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体,称为ABC法,其中A-Ab为亲和素化抗体,B-Ab为生物素化抗体。-酶免疫技术原理亲和素可预包被在酶标板孔内,然后再将生物素化抗体Ab(或抗原Ag)包被于孔内。通过BA将免疫复合物与酶连接起来,能有效地放大EIA法,使其灵敏性增强。优点生物素对抗体和酶的标记率高,又不影响其他活性。生物素亲和素的结合极为稳定,不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。每个亲和素分子能结合4个生物素,能耦合更多的联结生物素的酶分子,提高EIA的敏感性。