双水相萃取法ppt课件.ppt

第七节双水相萃取早在1896年,Beijerinck发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液,随之分为两相,上相含有大部分水,下相含有大部分琼脂(或淀粉),,,1956年瑞典伦德大Albertsson将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离。*双水相萃取技术(two-aqueousphaseextraction):利用不同的高分子溶液相互混合可产生两相或多相系统,静置平衡后,分成互不相溶的两个水相,利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法,称为双水相萃取法。特点:能保留产物的活性,操作可连续化,可纯化蛋白质2~5倍。*一、双水相的形成如葡聚糖与聚乙二醇按一定比例与水混合,静置平衡后,分成互不相溶的两个水相,上相富含PEG,下相富含葡聚糖*常用于物质分离的高聚物体系有:聚乙二醇(简称PEG)/葡聚糖(简称Dextran)常见的高聚物/无机盐体系为:PEG/硫酸盐或磷酸盐体系。*二、双水相萃取的基本概念(一)相图相图右上部为两相区,左下部为均相区,两相与均相的分界线叫双节线。组成位于A点的系统实际上由位于C、B两点的两相所组成,BC称为系线。当系线向下移动时,长度逐渐减小,表明两相的差别减小,当达到K点时,两相间差别消失,K点称为临界点。*(二)分配系数影响分配系数的因素包括很多,如粒子大小、疏水性、表面电荷、粒子或大分子的构象等,这些因素微小的变化可导致分配系数较大的变化,因而双水相萃取有较好的选择性。*三、影响双水相萃取的因素(一)、成相高聚物的分子量一般原则:对于给定的相系统,如果一种高聚物被低分子量的同种高聚物所代替,被萃取的大分子物质,如蛋白质、核酸、细胞粒子等,(MW500000)代替Dextran40(MW40000),即增大下相高聚物的分子量,被萃取的低分子量物质如细胞色素C分配系数增加并不显著。然而,被萃取的大分子量物质,如过氧化氢酶的分配系数可增大到原来的6‾7倍。*(二)成相聚合物浓度——界面张力一般来说,双水相萃取时,如果相系统组成位于临界点附近,则蛋白质等大分子的分配系数接近于1。高聚物浓度增加,系统组成偏离临界点,蛋白质的分配系数也偏离1,即K>1或K<1.(三)、电化学分配——盐类的影响盐对带电大分子的分配影响很大。各种盐的分配系数存在着微小的差异,产生了相间电位。由于蛋白质等大分子在水溶液中常带有电荷,相间电位造成的静电力能影响所有带电大分子和带电细胞粒子在两相中的分配。例如,DNA萃取时,离子组分微小的变化可使DNA从一相几乎完全转移到另一相。*(四)、疏水效应选择适当的盐组成,相系统的电位差可以消失。排除了电化学效应后,决定分配系数的其它因素,如粒子的表面疏水性能即可占主要地位。成相高聚物的末端偶联上疏水性基团后,疏水效应会更加明显,此时,如果被分配的蛋白质具有疏水性的表面,则它的分配系数会发生改变。(五)、温度及其它因素温度的影响是间接的,它主要影响相的高聚物组成,只有当相系统组成位于临界附近时,温度对分配系数才具有较明显的作用。pH对酶的分配系数也有很大关系,特别是在系统中含有磷酸盐时,由于pH的变化会影响磷酸盐是一氢化物还是二氢化物磷酸盐的存在,而一氢化物磷酸盐对界面电位有明显的影响*四、双水相萃取的应用应用特点:双水相系统平衡时间短,含水量高,界面张力低,为生物活性物质提供了温和的分离环境。它还具备操作简便、经济省时、易于放大。据报道,系统可从10ml直接放大到1m3规模(105倍),而各种试验参数均可按比例放大,产物收率并不降低。α-淀粉酶和蛋白酶用PEG/(NH4)2SO4双水相体系,经一次萃取从α-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶,萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)pH=8.*