质谱分析方法开发及优化(2014.2.24版).pdf

2014/3/1一、概述•LC-MS的实验目的•电离方式的选择􀂋ESI或APCI液质联用分析方法开发及条件􀂋正离子或负离子优化•色谱柱因素􀂋直径和流速􀂋管路连接(Plumbing)•流动相因素􀂋pH􀂋溶剂􀂋其他•液质联用应用实例二、样品的预处理为什么需要液相分离(一)、样品的预处理目的•认为LC/MS/MS不需要样品预处理的理解是片面的串联质谱具有高选择性,为什么需要液相分离•LC/MS/MS分析方法的现实情况–离子化过程中的基质效应•由于MS/MS有很好的选择性,用户很少能够“看到”基质MS/MS模式下,成百上千的基质谱峰是“看不见”的基质物质与分析物共同流出喷雾针时,可•MS/MS用户希望有最低的检测限,因此他们可能会进更多影响待分析物的雾化、挥发、裂分、化学反应的样品到LC/MS/MS系统当中及带电过程,导致进入质谱的离子减少(离子“看不见”的基质谱峰会变得更加严重抑制)或增多(离子增强),从而影响定量结•许多后流出化合物并不是完全适合色谱分析,因此色谱柱果的可靠性和准确性,以及方法的重现性及线当中会有残留物产生性–这些残留物会随着不断的进样而渐渐增多–改善线性和准确性–提高灵敏度–样品分析的越多,基质之间的互相干扰也越严重–更好的专属性•大量的基质会使离子源污染得更快并且损失灵敏度基质干扰:Loop进样基质干扰:用色谱柱将基质和分析物分离12014/3/1二、样品的预处理(二)样品基质影响(一)样品的预处理目的•从保护仪器角度出发,防止固体小颗粒堵塞进样质谱检测器可耐受挥发性缓冲盐的使用管道和喷嘴,防止污染仪器,降低分析背景,排然而…除对分析结果的干扰缓冲盐的类型和浓度干扰离子化过程•从ESI电离的过程分析ESI电荷是在液滴的表面,样品与杂质在液滴表面存在竞争,不挥发物(如磷酸盐等)防碍带电液滴表面挥发,大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态,增加电荷中和的可能(二)样品基质影响(三)样品的预处理常用方法•超滤•溶剂萃取/去盐•固相萃取•灌注(Perfusion)净化/去盐•色谱分离反相色谱分离亲和技术分离•甲醇或乙***沉淀蛋白•酸水解,酶解•衍生化三、LC-MS分析条件的选择1、液质联用技术的相对适用范围(一)、接口的选择•ESI和APCI在实际应用中表现出它们各自的优势和弱点•这使得ESI和APCI成为了两个相互补充的分析手段•概括地说,ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子,特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子(蛋白质)•只要有相对强的极性,ESI对小分子的分析常常可以得到满意的结果22014/3/12、接口的选择2、接口的选择(1)ESI和APCI的比较•APCI不适合可带有多个电荷的大分子,它的优势比较项目ESIAPCI在于非极性或中等极性的小分子的分析可分析样蛋白质、肽类、低聚核苷酸;非极性/中等极性的小分子,如脂品儿茶酚***、季铵盐等;含杂肪酸,邻苯二甲酸等;含杂原子化•ESI对高分子量生物大分子和聚合物电离会生成多原子化合物如氨基甲酸酯等,合物如氨基甲酸酯、脲等,可用热电荷离子,而APCI在任何化合物电离中不能产生可用热喷雾分析的化合物喷雾、粒子束技术分析的化合物多电荷离子,并以(准)分子离子为主不能分析极端非极性样品非挥发性样品,热稳定性差的样品•ESI多适合反相液相色谱样品基质和流对样品的基质和流动相组成对样品的基质和流动相组成的敏感•APCI要比ESI更适合正相液相色谱动相的影比APCI更敏感;对挥发性很程度比ESl小;可以使用稍高浓度的响强的缓冲液也要求使用较低挥发性强的缓冲液;有机溶剂的种的浓度;出现Na+,K+.Cl-,类和溶剂分子的加成影响离子化效-CF3COO等离子的加成率和产物(1)ESI和APCI的比较(2),影响离子化过程;溶电离方流速样品类型MW范围溶剂pH的调整会加强在溶剂pH对离子化效率式(mL/mi液中非离于化分析物的离子有一定的影响n)-多电荷离子<200,000流动相流速在低流速(<100µL)下工作良在低流速(<100µl)>1000DaDa好;高流速下(>750µl)比下工作不好;在高流+-3APCI差速下(>750µl)好于(M+H),(M-H)及其~-(M+H)+,(M-H)-及其<1000Da极性化合物可产生显著的碎脱水峰出现碎片片(3)离子化模式的选择(4)正、负离子模式的选择•一般的商品仪器中,ESI和APCI接口都有正负离子测定模No化合物是否是Y