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核酸含量的测定——紫外吸收法.doc

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核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基,这些碱基都具有共轭双键(-C-C=C-C=C-),在紫外光区的250-280nm处有强烈的光吸收作用,最大吸收值在260nm左右。常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。RNA的ε(P)260nm()为7700~7800,%,~。小牛胸腺DNA钠盐的ε(P)260nm()为6600,%,。测出260nm处的光吸收值,可计算出核酸的含量。当核酸变性降解时,其紫外吸收强度显著增加,称为增色效应。蛋白质也有紫外吸收,通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处,在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低,因此对于含有微量蛋白质的核酸样品,测定误差较小。若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质,则测定误差较大,应设法除去。不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。从A260/A280的比值可判断样品的纯度。纯RNA的A260/A280≥;DNA的A260/A280≥。当样品中蛋白质含量较高时,则比值下降。,表示此样品不纯。pH对核酸紫外吸收性有影响,所以在测定时要固定溶液的pH值。本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。 [方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支,,,***酸-钼酸铵沉淀剂,摇匀后置冰箱内30min,使沉淀完全。3000r/min离心10min,,定容至50mL。以蒸馏水作空白对照,使用紫外光

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核酸含量的测定——紫外吸收法.doc

紫外吸收法测定核酸含量

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