荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制(00002).docx

荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制荧光定量PCR之绝对定量分析——        绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。         将标准品稀释至不同浓度,作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以测得的CT值为纵坐标,绘制标准曲线,对未知样品进行定量时,根据未知样品的CT值,即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。*Log(起始浓度)与循环数呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系*由样品CT值,*必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增,并且扩增效率相同*标准品必须是经过准确定量的(我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计)*标准品必须是标准化的(例如,同一化的细胞数)*在每组实验时,必须用相同的阈值设定来确定CT值        标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA,也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物,当然也可以是基因组DNA,甚至cDNA,但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。             一般一条标准曲线取四到五个点,浓度范围要能覆盖样品的浓度区间,以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次,对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。倍比梯度稀释方法:1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液,得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液,得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液,得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液,得标准品v依次倍比稀释拷贝数的计算::将标准品依次进行10倍稀释,ASP-×108copy/ul标准曲线的绘制(1cycle=1min)设置对照:×107、×106、×105、×104、×103、×102、×101的标准样品各一个,设空白对照PCR反应:以不同浓度标准品作为模板