毕业论文：小鼠microRNA-125b过表达载体构建.docx

目录摘要 1Abstract 31前言 42材料与方法 93结果与分析 94讨论 115结论 116参考文献 12致谢 14摘要NPC1是一种以溶酶体内脂质异常沉积为特征的中枢神经系统退行性疾病,迄今为止对NPC1的发病机制仍得不到合理的解释。研究发现miRNA对tau蛋白的调控和神经元存活至关重要,通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶来调节tau蛋白磷酸化水平。Tau 蛋白过度磷酸化损伤神经细胞功能和结构,如过度磷酸化使Tau 蛋白结合微管能力降低[1],Tau 蛋白在神经元内聚积导致神经元轴突转运障碍[2]、乙酰胆碱释放减少[3]、蛋白酶体活性抑制[4-7],这些功能和结构的改变可能导致神经元呈慢性进行性变性构建miR-125b表达载体,从tau蛋白磷酸化调控的研究入手,系统地研究参与tau蛋白磷酸化调控的miR-125b的靶基因,阐释其中的分子作用机制,为tau蛋白异常病变引起的神经退行性疾病的研究与防治提供新的思路。本实验目的:构建小鼠microRNA-125b(miR-125b)过表达载体。方法:参考小鼠miR-125b前体序列的PCR扩增引物,重新设计限制性内切酶位点为NheI和EcoRI,PCR扩增,-EGFP质粒进行双酶切鉴定,使用T4DNA连接酶进行连接,转化DH5α感受态细胞,挑取重组阳性克隆,对重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。结果:菌液PCR筛选鉴定出正确的miR-125b过表达载体,测序分析证实克隆的基因序列正确。结论:成功构建小鼠miR-125b的真核表达载体,为进一步研究miR-125b在C1型尼曼-匹克病中调控tau蛋白磷酸化的作用机制奠定实验基础。关键词:microRNA-125b;-EGFP;过表达载体ConstructionofmicroRNA-125boverexpressionvectorinmouseAbstractObjectiveToconstructthemicroRNA-125b(miR-125b)-125bprecursorsequencereferredtoarticle,,-EGFPplasmidwereidentifiedbydoubledigestion.,,,binantplasmidwerepicked,andidentifiedbydoubledigestion,---essfullyconstructed,whichprovidesafoundationforfurtherstudyingthemechanismoftauphosphorylationregulatedbymiR-125binNiemann-:microRNA-125b,-EGFP,Overexpressionvector一、前言microRNA(miRNA,微小RNA)是一类长约20-24个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA,进化上具有高度保守性,广泛存在于真核生物中。成熟miRNA能够与靶基因3′UTR以完全互补或不完全互补的形式结合,诱导靶mRNA降解或抑制蛋白翻译,导致相应蛋白质合成缺失或减少,从而在转录水平、转录后水平、表观遗传水平等调控基因表达,参与生命过程中一系列的重要进程[1]。到目前为止,在人类和小鼠中分别发现超过1000和750种miRNA,其中一些