防腐挑战实验.doc

防腐挑战实验第一部分防腐挑战实验调研结果1实验样品样本要求新鲜,没有被微生物污染,一般每个样本为300g。、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异(如表1),国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会(CTFA)推荐的菌种(因其较具代表性,如表2所示),所以更为恰当。(注意菌株来源问题:同属一个种的细菌来源不同,菌株不同,MIC值不同)表1某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株菌株美国(药典)美国(ISP公司)英国(药典)德国(Henkel公司)德国(S&M公司)白假丝酵母√√√√√黑曲霉√√√√√红色青霉√绿色木霉√绳状青霉√大肠埃希氏菌√√√√镉绿假单胞菌√√√√金黄色葡萄球菌√√√√√粪肠球菌√产气肠杆菌√表皮葡萄球菌√日勾维肠杆菌√洋葱假单胞菌√√肺炎克雷伯氏菌√恶臭假单胞菌√荧光假单胞菌√表2CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择种类菌株数量革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌至少选一种表皮葡萄球菌发酵革兰氏阴性杆菌肺炎克雷伯氏菌至少选两种阴沟肠杆菌大肠埃希氏菌变形菌属日勾维肠杆菌非发酵革兰氏阴性杆菌铜绿假单胞菌至少选一种洋葱假单胞菌荧光假单胞菌恶臭假单胞菌黄杆菌属不动杆菌属酵母白假丝酵母至少选一种***、(1)标准悬液的配制1%%***,混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml,此悬液再做3倍稀释。(2)细菌菌悬液的配制实验前将菌株接种到各个培养基斜面上,36摄氏度恒温培养48小时。将已培养好的活性菌种,用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中,充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释,浊度和标准悬液的浊度(3×108cfu/ml)相同为止;此时的稀释菌液再做3倍稀释,即为所需的1×108cfu/ml的菌悬液,做细菌总数确定细菌数。(3)霉菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种,用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中,充分振荡摇匀;用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释,每次的稀释用血球计数板计数,必须5个中格的霉菌总数在190~210,落在此范围内的菌悬液为我们所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液,做霉菌总数确定霉菌数。(1)单菌接种:每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性,在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值,但工作量大、费时、费工,和产品的实际污染菌情况也有差距(因来自自然界的微生物常常不是单一的种类)。(2)混合菌接种:西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式,除了因工作量相对较小外,这种接种方法更能代表污染的状况。(1)一次接种:只是在试验开始时接种一次,整个试验周期28天。(一次加菌的28天微生物挑战实验)(2)多次接种:在试验开始接种一次后(重复加菌的微生物挑战实验)a法:第21天再接种一次,试验周期为28天。(有实验表明,第21天接菌和不接菌时,第28天时的微生物含量并无显著的差别,评定结果也相同)b法:每隔两周接种一下,连续三次(即第1、3、5周接菌,每两周接菌前分离一次),试验周期为49天;c法:每周接种一次,连续5次,试验周期为35天。(S&M公司的资料介绍,采用此种方法评价认可的防腐体系,可保证产品30个月内的防腐安全),×107~1×108cfu/ml的细菌悬液及霉菌悬液,用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜,±℃的培养箱中培养,±℃的培养箱中培养。,稀释后取1ml样品液,加入9ml灭菌生理盐水中,做依次稀释,分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度;取三个合适稀释度的样液,分别吸取1ml样液加入已灭菌的平皿中,做菌落计数,并做两个平行。,加入10ml无菌吐温-80和10ml无菌白矿油,再加70ml无菌生理盐水,用无菌玻棒充分混匀;吸取1ml已稀释的样品液,加入9ml灭菌生理盐水中,做依次稀释,分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度;取三个合适稀释度的样液,分别吸取1ml加入已灭菌的平皿中,做菌落计数,并做两个平行。±℃的培养箱中培养;±℃的培养箱中培养;混合菌在28℃的培养箱中培养。、7、14、21、28天分离计算样品中活的细菌、霉