间充质干细胞的分离及其类髓核细胞分化导向.docx

间充质干细胞的分离及其类髓核细胞分化导向间充质干细胞具有较强的增殖能力和多向分化能力,以下是搜集的一篇关于间充质干细胞分离研究的,欢迎阅读参考。前言间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是来源于中胚层的未分化的发育早期细胞,具有较强的增殖能力和多向分化能力。在特定的内环境和一定的细胞因子的诱导作用下,其可定向分化为多种组织细胞,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞、成纤维细胞等,正是由于其所具有的特性,使其成为了组织工程学中最常用的种子细胞。由于骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)具有取材方便、体外培养简单、繁殖能力强、供体创伤小、不涉及伦理问题、良好的组织相容性、及其低抗原性所表现出的低免疫反应性等优点,使其成为了组织工程中经常使用的间充质干细胞。国内外均有使用一定的细胞因子诱导BMSCs增殖和分化为类软骨细胞及类髓核细胞的相关报道。本实验抽取新西兰兔的骨髓细胞,利用全骨髓贴壁法分离间充质干细胞,经过传代培养后再通过中胚层定向诱导分化的方法对所获取的细胞进行鉴定,确定其定向分化能力,再以转化生长因子3(TransformingGrowthFactor-3,TGF-)和骨形态发生蛋白7(icProtein-7,BMP-7)生长因子诱导其向类髓核细胞分化,为组织工程髓核的构建提供良好的种子细胞选择。 1、材料和方法 DMEM-LG培养基(Gibcol)、胎牛血清(Gibcol)、DMEM-HG培养基(Gibcol)、成骨诱导培养基(地塞米松10-9M,,-甘油磷酸钠10mM,5%FBS,DMEM-LG培养基,1%双抗溶液)、成软骨诱导培养基(地塞米松10-7M,,***酸钠1mM,转化生长因子-110ng/ml,ITS+LA,DMEM-HG培养基,2%FBS,1%双抗溶液)、成脂肪诱导培养基(地塞米松10-7M,,,2%FBS,DMEM-HG培养基,1%双抗溶液)、茜素红S(Roche)、羊抗牛Ⅱ型胶原多克隆抗体(SouthernBiotechno-logy)、番红O(Sigma)、油红O(Sigma)、TGF-3(sigma)、BMP-7(sigma),CD29、CD105、CD166均购自eBioScience。新西兰兔购自上海生旺实验动物养殖有限公司。 ,雌雄不限,戊巴比妥溶液腹腔麻醉后,常规备皮,消毒,严格无菌操作,以骨髓穿刺针接10ml注射器(注射器内含稀释的肝素钠3000U/)自胫骨近端内侧处行骨髓穿刺术,抽取骨髓液3ml,缓慢注入预置4ml淋巴细胞分层液的离心管内,进行密度梯度离心。2000rpm离心20分钟后,吸取中间的单个核细胞层,弃去上清和脂肪,PBS(PhosphateBufferedSaline,磷酸盐缓冲液)缓冲液冲洗2次,×104/cm2的浓度接种于100mm培养皿内,加入15mlHam’sF12培养液(含青霉素钠100U/ml,链霉素100g/ml,***),加入胎牛血清终浓度为10%,置37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养,于48小