琼扩试验检测马传贫试验步骤.doc

马传染性贫血琼脂扩散试验-马传贫防治技术规范(2008),加到100m1磷酸缓冲液(PBS)中,加入1%硫柳***溶液1m1,使用电磁炉/沸水浴/电炉煮沸等方式使其充分融化。冷至45℃~55℃时,将洁净干热灭菌直径为90mm的平皿置于平台上,每个平皿加入15~18ml,加盖待凝固后,把平皿倒置以防水分蒸发,放普通冰箱(4℃)中保存备用(保存时间不超过2周)。(1)打孔在制好的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔(中间1孔,周围6孔),孔径5mm,孔距3mm(2~5mm)(如实图),将孔内的琼脂用注射针头斜面向上从右侧边缘插入,轻轻向左侧方向将琼脂挑出,勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。(2)封底用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂板底部刚刚要溶化(手背感觉微烫手)为止,封闭孔底部,以防侧漏。(3)加样用微量移液器或带有6~,吸取“标准抗原”滴入中间孔,“标准阳性血清”分别加入对称的两个孔中(例如1和4孔,或者2和5),被检马血清按编号顺序分别加入另外4个外孔。每孔均以加满不溢出为度,每加一个样品应换一个滴头,避免污染。(4)反应(扩散)加样完毕后,静置5~10min,然后将平皿轻轻倒置放入湿盒内,置于15-30℃条件下反应,逐日观察3天并记录结果。(1)判定方法将琼脂板置日光灯或侧强光下观察,若标准阳性血清(图中1和4号孔)与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线,则试验成立。阳性:当检验用标准阳性血清孔与抗原孔之间只有一条明显致密的沉淀线时,受检血清孔与抗原孔之间形成一条沉淀线;或者阳性血清的沉淀线末端向毗邻的受检血清的抗原侧偏弯者,此种受检血清判定为阳性。阴性:受检血清与抗原孔之间不形成沉淀线,或者标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线向毗邻的受检血清孔直伸或向受检血清孔侧偏弯者,此种受检血清为阴性。疑似:标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端,似乎向毗邻受检血清孔内侧偏弯,但不易判断时,可将抗原稀释2倍、4倍、6倍、8倍进行复试,最后判定结果。观察时间可延至5天。注意事项:<1>判定结果时,应从不同折光角度仔细观察平皿上抗原孔与受检血清孔之间有无沉淀线;<2>判断时要注意非特异性沉淀线。