水稻愈伤转化.doc

水稻愈伤组织转化实验目的掌握植物组织培养的基本原理;学****水稻愈伤组织的诱导方法;学****农杆菌转化法的原理,掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法;学****转基因植株的各种鉴定方法(包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH等),同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。实验原理植物组织培养植物组织培养(planttissueculture)是指在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等,在人工控制的培养基上培养,使其生长、分化以及形成完整植株的技术。自1902年Haberlandt首先用紫鸭跖草(Tradescantia)的叶片栅栏组织进行培养来,植物组织培养已有100余年历史。用于离体培养的各种植物材料称为外植体(explant)。根据外植体的类型,又可将组织培养分为:器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。(从这个角度讲,本学期的实验属于胚胎培养。)植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。基因工程基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”,并按照人们的意愿重新组合,以改变生物的性状和功能,然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞内,并使其在生物体内或细胞中表达,从而获得新的生物机能。这种利用基因工程技术获得的植物一般称为“基因工程植物”。自1983年首次获得转基因植物以来,转基因技术发展十分迅速,成功进行转基因的植物已达60多种,在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例,有些转基因产品已进入市场。通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。农杆菌转化法转基因的方法有很多,对于植物而言,最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌,其内含Ti质粒:T-DNA(TransferreDNA)区:农杆菌Ti质粒中向植物中转移并整合进植物基因组中的部分。T-DNA区大小为10-30Kb,左右边界高度保守,为25bp正向重复序列。根癌农杆菌进行转化时,只识别左右边界(尤其是右边界在转化时最为重要),而T-DNA区内为什么基因则不影响转化。因此我们可以通过基因工程改造T-DNA区,转化目的基因。毒性蛋白(Virulence)区:越20Kb,包括A、B、C、D、E、F、G等基因区,有些基因区含多个基因,形成操纵子结构。毒性蛋白区在侵染植物细胞的过程中起重要作用。农杆菌转化过程:植物受伤部位酚类化合物的分泌;附着(染色体毒性基因ChvA、ChvB);VirA/G的双元系统感受受伤信号;其他Vir基因的表达;T-DNA链的切出(VirD1+VirD2);plex(T复合体)的形成;运输(从细菌中输出、进入植物细胞、入核);整合。植物受伤后的分泌物中含有酚类物质,这些酚类物质可以被农杆菌感知,借助于趋化性迁移至植物受伤部位,在ChvA、ChvB的帮助下,附着到受伤部位。【因此在人工进行农杆菌侵染时,需要加入乙酰丁香***(AS)吸引农杆菌,乙酰丁香***即起到和植物受伤后分泌的酚类物质相同的作用。】VirA识别植物受伤后分泌的酚类物质信号,进行自磷酸化,进而将磷酸化信号传VirG——这是典型的细菌双元信号传导系统。VirG磷酸化后被活化,作为转录因子启动或增强各毒性蛋白的表达。VirD2在D1的帮助下识别T-DNA区2