蛋白质免疫印迹技术及.ppt

蛋白质免疫印迹技术及WesternBlot简介WesternBlot一般流程WesternBlot常见问题分析WesternBlot简介:印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年,Southern建立了将DNA转移到***纤维素膜(NC膜)上,并利用DNA-RNA杂交检测特定的DN***段的方法,称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。WesternBlot基本原理WesternBlot优点高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应1-5ng中等大小的靶蛋白WesternBlot应用目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析WesternBlot流程蛋白样品的制备SDS-PAGE转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、***和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的提取蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量:Bradford法(考马斯亮蓝法)、Lowry法(Folin-酚试剂法)、BCA法等。但各有优缺点,大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作,测定样品浓度。蛋白质浓度测定的各种方法汇总:http://bbs./thread-23639-1-×SDS-PAGE上样缓冲液:DTT可临用前以1:4比例混合加入,亦可全部配好分装,-20℃冻存。按1:1比例与蛋白质样品混合,95~100℃加热5~15min,冰上冷却后再上样,上样量一般为20-25μl,总蛋白量20~50μg。1MTris-HCl()-HCl()200mMDTT4%%溴酚兰20%甘油ddH2O