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Real-time-qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手-生物吧Real-timeqPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手时间:2012-03-0521:22来源:生物吧作者:刘浩点击:13338次由于Real-timeqPCR的众多优点,现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验,也基本上被real-timeqPCR所代替。由于real-timeaPCR输出的数据不同于常规的由于Real-timeqPCR的众多优点,现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验,也基本上被real-timeqPCR所代替。由于real-timeaPCR输出的数据不同于常规的PCR电泳检测,很多没有做过real-timeqPCR的研究者常常感到高深莫测,不知从何入手;甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑,不知所措。本文就从real-timeqPCR的发展史说起,包括real-timeqPCR的原理,实验设计,实际操作,数据分析,常见问题解答五个方面,手把手教你从各个方面了解real-timeqPCR,彻底的从菜鸟到高手!一、Real-timeqPCR发展史Real-timeqPCR就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点,real-timeqPCR由于其操作简便,灵敏度高,重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域,比如基因的差异表达分析,SNP检测,等位基因的检测,药物开发,临床诊断,转基因研究等。在Real-timeqPCR技术的发展过程中,定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年,美国PE公司(已经并入Invitrogen公司)成功研制了Taqman技术,1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统,通过检测每个循环的荧光强度,通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500,7700、7900HT、StepOnePlusTM、M、******@M系列;BIO-RAD的CFX96、iCycleriQ5@、MyiQ@、MJResearchChromo4TMOpticon系列;StratageneMxTM系列;RocheLightCycler@系列;EppendorfMasercycler@;CorbettRotor-M;CepheidSmartCycler@和BIOER的LineGene系列。随国内生命科学的快速发展,科研水平不断提高,发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时,国内公司经过长期不懈的努力,也有自主研发的real-timePCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。二、Real--timeqPCR原理实时PCR就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。一般来讲,定量PCR仪包括:实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同,不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种:卤钨灯和LED;荧光检测元件常用两种方式:D摄像机,光单色元件有滤光片和光栅。在实时PCR扩增过程中,荧光信号被收集,转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线,荧光阈值和Ct值。-timeqPCR的数学原理首先来看一个real-timeqPCR中的重要参数Ct值(Ctvalue),阈值(threshold),和基线(baseline)。一般来讲,第3-15个循环的荧光值就是基线,是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节,位于指数期就可以。Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。所以是一个没有单位的参数。那么为什么说Ct值跟初始模板的量成反比呢?我们来看PCR的扩增方程:    从线性方程上看,斜率(slope)为-1/lg(1+E),所以E=10-1/slope-1。如果从标准曲线上得到斜率(-),就可以算出扩增效率()。一般来讲PCR扩增效率在90%-110%都是可以用于数据分析的。效率低于100%,是由于PCR反应中存在抑制因素;而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。-timeqPCR的种类根据real-