ESAT6-CFP10载体构建.ppt

ESAT6-CFP10重组基因载体构建1ESAT6、CFP10引物设计2ESAT6、CFP10目的基因PCR扩增3pET30a-ESAT6质粒的构建4pET30a-ESAT6-CFP10质粒构建1ESAT6、CFP10基因引物设计ESAT6基因引物(,引物设计演示)UpperPrimer:5'ATATGACAGAGCAGCAGTG3'LowerPrimer:5'AGTGACGTT3'GAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCATAG1引物长度一般在15~30碱基之间引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。2引物GC含量在40%~60%间,Tm值最好近72℃ position)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。3引物3′端不能选择A,最好选择T。(引物3′端错配)4引物自身及引物之间不应存在互补序列。(发夹结构、二聚体)5引物的5′端可以修饰,而3′端不可修饰65′端和中间G值应相对较高3′端较低引物设计原则CFP10基因序列引物UpperPrimer:5'GAT3'LowerPrimer:5'ATTTGCGAG3‘、(ESAT6基因)反应体系单位(μl)×(ESAT6基因)96℃预变性3min;96℃变性45sec、62℃退火45sec、72℃延伸1min,共30次循环;72℃延伸7min。PCR的反应原理◆PCR反应体系上下游引物(10-50pmol)缓冲液()Mg2+(-)dNTPs()TaqDNA聚合酶()DNA模板(1ng)◆PCR循环的主要参数预变性:90℃-96℃,2-5min变性:90℃-96℃,30s-1min复性:40℃-65℃,20s--2min延伸:68℃-75℃,30s--3min循环:25-35次总延伸:72℃,7min◆PCR技术的特点高度敏感性高度特异性操作简便适用广泛电泳1%-2%琼脂糖凝胶电泳基因DNA纯化回收(凝胶回收试剂盒)Promega、Takara等测序及结果分析分析软件:DNAMan、DNAStar、BioEdit、ClustalX等(软件使用演示)3pET-30a-ESAT6载体构建载体pET-30a与ESAT6基因双酶切DoubleDigestion(双酶切反应)时UniversalBuffer(通用缓冲液)(1)反应体系ESAT6DNA(2)载体pET-30addH2O24μlddH2O24μlESAT6DNA17μlpET-30a17μl10×T5μl10×T5μlKpnⅠ2μlKpnⅠ2μlNdeⅠ2μlNdeⅠ2μl总体积50μl总体积50μl按上述反应体系加样,然后将反应管置PCR扩增仪上,37℃酶切2-3。pET-30a质粒和ESAT6双酶切产物的纯化回收(DN***段回收试剂盒)