引物设计的原则.doc

引物设计的原则引物设计有3条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配).具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素,如引物长度(primerlength),产物长度(productlength),序列Tm值(meltingtemperature),引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用G值反映),形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构(duplexformationandhairpin)的能值,在错配位点(falseprimingsite)的引发效率,position),等等。必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点,引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结,引物设计应注意如下要点:一、引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。二、引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基,,也会使错误引发机率增加。三、引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。四、引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。五、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。六、G值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端G值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间G值相对较高的引物。引物的3’端的?G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。七、引物二聚体及发夹结构的能值过高()易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。八、对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。值得一提的是,各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难,例如GC含量偏高或偏低,导致找不到各种指标都十分合适的引物;在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次,尽量去满足条件。引物的自动搜索和评价分析软件的引物设计功能主要体现在两个方面:首先是引物分析评价功能,该功能只有少数商业版软件能够做到,其中以“Oligo6”最优秀;其次是引物的自动搜索功能,各种软件在这方面的侧重点不同,因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验,自动搜索功能以"PremierPrimer”为最强且方便使用,"Oligo6”其次,其他软件如“VectorNTISuit”、“Dnasis”、“Omiga”和“D