琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤说课材料.ppt

琼脂糖凝胶电泳Agarosegelelectrophoresis天然琼脂(agar):又名琼胶、菜燕、冻粉是从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。琼脂糖(agarose)半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷D-,易破碎,浓度不能太低。,不易保存,临用前配制。,电泳后必须立即固定染色。,分子筛作用小,区带少。一、实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。二、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭(EthidiumBromide,EB)为扁平状分子,在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物,其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。三、实验材料、器具及药品质粒DNA样品。电泳仪,电泳槽,电子天平,移液器,枪头,微波炉,紫外透射检测仪等。琼脂糖,1XTBE电泳缓冲液,溴化乙锭(EB),6X载样缓冲液四、实验步骤⑴1g琼脂糖加入100ml1×TAE电泳缓冲液中,摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。(冷却到60℃,,并摇匀。)⑵用胶带将制胶板两端封好,插入适当梳子,将溶解的琼脂糖(约50℃)倒入,室温冷却凝固。⑶充分凝固后撕掉两端的胶布,将凝胶置入电泳槽中,加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm,小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上,再加入2μl的6X载样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔。⑸打开电源开关,调节电压至3-5V/cm,可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动,电泳约30min-60min。⑺将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上,盖上防护观察罩,打开紫外灯,可见到发出荧光的DNA条带。⑹将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。