4质粒在hek293细胞的表达及电流特征..doc

4质粒在HEK293细胞的表达及电流特征        【摘要】 目的研究大鼠心室肌细胞超极化环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)基因瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293)表达和通道电流特征。4基因pTracer-CMV-GFP穿梭载体,转染HEK293细胞进行扩增,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)4mRNA表达,4电流。结果大鼠起搏通道基因瞬时转染HEK293细胞,记录到一系列超极化内向离子流,该电流呈电压、时间依赖性,没有明显的失活,在-150mV时电流幅值为(540±)pA,电流密度为(±)pA/pF(n=12),半激活电压(V1/2)为(-±)mV,稳态激活曲线斜率(k)为-,HCN4电流翻转电位为(-±)mV。4基因的异源性表达。【关键词】 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道;异源性表达;膜片钳;大鼠 Abstract:Objective  4genefragmentwasclonedintotheshuttleplasmidpTracer-CMV--PCRmethodafterbeingtransfectedintotheHEK293cellusingLipofactamine2000reagentforamplification, 4channelbegantoactivateinvoltageandtimedependentmannerwithoutdeactivationthresholdvoltageandpotentialofhalf-maximalactivation(V1/2)was-70mV,(-±)mV, ransfected. Keywords:ucleotidegatedcationchannel;heterologouslyexpressed;patchclamprecordings;rat  心脏节律的形成和维持依赖于起搏细胞动作电位4相自动除极化。作为组织自动除极最主要电流之一,起搏电流(pacemakercurrent,If)无论在自律细胞的起搏[1],还是工作肌细胞异位节律增高方面均起着关键性作用。编码If通道的基因家族在鼠和人类已经被克隆[2-3],1~HCN4,超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)基因是心脏正常起搏活动至关重要的分子基础,起博电流表现为广泛的区域电压依赖性,4[4],含量最高,HCN4是绝对优势的亚型,mRNA的80%以上。HEK293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞,贴壁生长,能转运多数核苷酸翻译后的成熟蛋白。4和携带绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的质粒表达载体pTracer-CMV-GFP进行共转染[5],通过瞬时表达进行检测,4通道电流的特征。 1 材料与方法