蚯蚓纤溶酶抑制胃癌细胞株mgc803 增殖及诱导凋亡的作用..doc

蚯蚓纤溶酶抑制胃癌细胞株MGC803增殖及诱导凋亡的作用        【摘要】 目的:研究蚯蚓纤溶酶对人胃癌细胞株MGC803抑制增殖及诱导凋亡的作用,并初步探讨蚯蚓纤溶酶诱导凋亡的作用机制。方法:采用MTT法观察蚯蚓纤溶酶对MGC803细胞增殖的影响,DNA凝胶电泳技术观察凋亡细胞变化,流式细胞术观察细胞凋亡率的变化,免疫细胞化学染色法检测蚯蚓纤溶酶对MGC803细胞p53蛋白表达的影响。结果:蚯蚓纤溶酶对胃癌细胞增殖有明显抑制作用,呈剂量依赖性。蚯蚓纤溶酶4uku·ml-1作用于胃癌细胞48h后,DNA琼脂糖凝胶电泳观察到典型梯状条带。蚯蚓纤溶酶浓度分别为2、4、8uku·ml-1作用于胃癌细胞48h后均可诱导细胞凋亡,各组细胞凋亡率分别为(±)%、(±)%、(±)%,与对照组相比,凋亡率升高有统计学意义()。蚯蚓纤溶酶2、3uku·ml-1组作用于细胞48h后,p53蛋白表达减少,±、±,与对照组相比,差异有统计学意义()。结论:蚯蚓纤溶酶在体外可以抑制MGC803细胞增殖,其机制可能与蚯蚓纤溶酶抑制p53蛋白表达并诱导细胞凋亡有关。【关键词】 蚯蚓纤溶酶人胃癌细胞细胞凋亡p53蛋白  蚯蚓纤溶酶是从鲜蚯蚓中提取的活性成分,在体内外对肿瘤细胞均有杀伤作用,但其作用机制一直未能得到充分阐明。研究表明,蚯蚓提取物在体外对多种人癌细胞株有抑制作用[13] ,其抑制肿瘤细胞生长的活性成分主要是纤溶酶和纤溶酶原激活酶。李洪燕等用人胃癌BGC823和人乳腺癌B37裸鼠移植瘤模型对蚯蚓纤溶酶进行体内抗肿瘤药效学观察,显示纤溶酶对两种裸鼠移植瘤生长均有抑制作用。本实验在体外研究蚯蚓纤溶酶对胃癌细胞的抑制作用,并初步探讨其作用机制。  1 材料和方法   材料  蚯蚓纤溶酶由南京农业大学免疫生化研究所分离提取,胃癌细胞株MGC803由解放军第81医院全军肿瘤中心传代保存。RPMI1640培养基(GIBCO公司),胰蛋白酶(Sigma公司),MTT(Amresco公司),AnnexinVFITC/PI试剂盒(美国BD公司),鼠抗人p53单克隆抗体、即用型SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物公司);酶联免疫检测仪(BIORAD550,美国伯乐公司),FACSVantageSE型流式细胞仪(美国BD公司)。   方法   细胞培养 MGC803细胞于含10%小牛血清、青霉素100U·ml-1、链霉素150μg·ml-1的RPMI1640培养基中,在37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。%胰蛋白酶消化传代。   MTT比色分析 取对数生长期的MGC803细胞,用含10%小牛血清的培养液调整细胞浓度为5×104ml-1,接种于96孔板,每孔200μl。37℃、5%CO2恒温培养24h后更换为无血清的RPMI1640培养液,继续培养24h,使细胞同步化。分为实验组(再分为蚯蚓纤溶酶1、2、3、4、5、6、7、8uku·ml-1组)、空白组(不加细胞)和对照组(不加药),每组设3个复孔,培养48h后每孔加入MTT20μl(5mg·ml-1),继续培养4h,吸去上清液,每孔加入DMSO150