脂质体转染技术步骤..doc

脂质体转染实验步骤脂质体(LR试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物(1:1。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下最方面的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高5-100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时,首先需要优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1-5ug和孵育时间6h,开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者最佳的剂量,确定出转染时间。因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24h为宜。细胞种类:COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。1、操作步骤(方法一:(1:取6孔培养板,向每孔中加入2ml含(1-2x10^5个细胞的培养基,37℃、18%CO2培养基40%-60%汇合时。(2转染液制备:在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染1个空细胞所用的量。A液:用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug,终量100ul。B液:用不含血清培养基稀释LR,使终浓度为2-50ug,终量100ul。轻轻混合A液、B液,室温中置10-15min,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染。(3转染准备:用2ml不含血清培养基漂洗2次,再加入1ml不含血清培养基。(4转染:把A/B复合物缓缓加入培养基中,摇匀,置37℃温箱中6-24h,吸除无血清转染液,换入正常培养基继续培养。(5其余处理:如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。(6注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。2、快速脂质体转染法操作步骤(方法二:●∙∙∙∙∙∙∙将细胞以5x10^5个/孔接种于6孔板中培养24h,使其达到50%-60%板底面积。●∙∙∙∙∙∙∙在试管中配制DNA-脂质体复合物。a、在1ml无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNA。b、旋转1s,再加入脂质体悬液,旋转。c、室温下放置5-10min,使DNA结合在脂质体上。●∙∙∙∙∙∙∙弃去细胞中的旧液,用1ml无血清DMEM洗细胞1次后弃去,向每孔中直接加入1mlDNA-脂质体复合物,37℃培养3-5天。●∙∙∙∙∙∙∙再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,继续培养14-24h。●∙∙∙∙∙∙∙吸出DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM,2ml/孔,再培养24-48h。●∙∙∙∙∙∙∙用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。3、稳定的脂质体转染法:●∙∙∙∙∙∙∙接种细胞同前述,细胞长至50%板底面积可用于转染。●∙∙∙∙∙∙∙DNA-脂质体复合物制备转染细胞同前。●∙∙∙∙∙∙∙在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM,37℃培养48h。●∙∙∙∙∙∙∙吸出DMEM,用G418选择性培养基稀释细胞,使细胞生长一定时间,筛选转染克隆,方法参照细胞克隆筛选法进行。细胞转染技术总述一、细胞转染途径转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于物理介导技术;化学介导方法很多,如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的