毕赤酵母表达系统资料整理.doc

毕赤酵母表达系统资料整理.doc:..毕赤酵母表达系统Milt*和Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶一一A0X1及A0X2,细胞中大多数的醇氧化酶是A0X1基因产物,甲醇可紧密调节、诱导A0X1基因的高水平表达,较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步:抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说,在含葡萄糖的培养基中,即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此,用甲醇进行优化诱导时,推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时,仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达,诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离,含AOX1启动子的质粒可用來促进编码外源蛋白的冃的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性,但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多,通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白腺、葡萄糖)培养基中,不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的,存在甲醇的情况下,Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时,Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。菌株GS115、X・33、KM71和SMD1168的区别GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌,与酿酒酵母相比,毕赤酵母不会使蛋白过糖基化,糖基化后有利于蛋口的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变,是组氨酸缺陷型,如果表达载体上携带有组氨酸基因,可补偿宿主菌的组氨酸缺陷,因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌口发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10$。GS115表型为Mut+,重组表达载体转化GS115后,长出的转化子可能是Mut+,也可能是Muts(载体取代AXO1基因),可以在MM和MD培养基上鉴定表型。SMD1168和GS115类似,但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突变,是蛋白酶缺陷型,可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。其屮X・33由于是野生型,因此耐受性比较好,如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌,而X33与GS115-样都是属于MUT+表现型,也就是说可以在含甲醇的培养基屮快速生长,但是据说会对外源基因表达有彫响,KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变,在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOXI基因的BamHI(AOXl基因15/16密码子SalI(AOXl基因227/228密码子)位点,取代了AOX1基因16-227密码子,此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)屮,分离产生KM71MutsArg+His-菌株,A「g+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aoxl::ARG4结构所収代,所以KM71所有转化子都是Muts表型。AOX1位点没有被完全缺失,理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换aoxl::ARG4结构,这样重组菌株的表型是His+MutsAg,这意味着重组菌株生长时需精氨酸。但仅添加精氨酸并不能完全缓和arg4突变的影响,arg4菌株