实验九底物浓度对酶促反应速度的影响.ppt

实验目的1了解底物浓度对酶促反应速度的影响。2学****测定米氏常数的原理和方法。实验原理1913年,Michaelis和Menten提出了酶促反应速度和底物浓度的关系式,即米氏方程。υ=V×[S]/(Km+[S])式中:υ为反应初速度V为最大反应速度[S]为底物浓度Km为米氏常数Km值是酶的一个特征性常数,可近似表示酶与底物的亲和力。Lineweaver-Burk作图法是用实验方法测定Km值的最常用的方法。Lineweaver–Burk的作图法—双倒数作图法。1Km11=+VVmax[S]Vmax取米氏方程式的倒数形式:1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常数Km的测定实验时选择不同的[S],测定相对应的υ。求出两者的倒数,以1/υ对1/[S]作图,则得到一个斜率为Km/V的直线。将直线外推与横轴相交,其横轴截矩为:-1/[S]=1/Km,由此求出Km值。该法比较简便。本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例,采用Lineweaver-Burk双倒数作图法测定Km值。胰蛋白酶能催化蛋白质中碱性氨基酸(L-精氨酸和L-赖氨酸)的羧基所形成的肽键水解。水解时生成自由氨基酸,故可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量来追踪反应。甲醛滴定法由于氨基酸分子在溶液中主要是***离子,故不能用酸、碱滴定其含量。但氨基酸的氨基可与甲醛反应生成羟***和二羟***氨基酸,使上述平衡向右移动,促使氨基酸分子上的一NH3十基解离释放出H+,从而使溶液酸性增加,就可以酚酞作指示剂用NaOH来滴定。小知识点:酚酞是碱性指示剂(变色范围是碱性),酸滴碱时用碱性指示剂;反之碱滴酸时用酸性指示剂比如***橙***红。三、器材锥形瓶滴定管移液管水浴锅量筒等四、、操作分别向6个小锥形瓶中加入5mL甲醛溶液和1滴酚酞,,直至混合物呈微粉红色。注意:每个锥形瓶中的颜色应一致。取100mL酪蛋白溶液,加入另一锥形瓶中,在37℃水浴中保温10分钟。将胰蛋白酶也在37℃水浴中保温10分钟。然后精确量取10mL酶液加到酪蛋白溶液中(同时计时)。充分混合后,随即取出10mL反应混合物(作为零时的样品)吹至一含甲醛的锥形瓶中。,直至混合物呈微粉红色,。在2、4、6、8和10分钟时,分别取出10mL消化样品,准确照上法操作。注意:在每个样品中滴定终点的颜色应当一致。用增加的滴定度对时间作图,测定初速度。配制不同浓度的酪蛋白溶液(、10、15、20、30g/L)测定不同底物浓度时的活力。用实验测得的结果,以以1/υ对1/[S]作图,求出V和Km的数值。