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文档分类:高等教育 > 生物学

蛋白质含量测定方法总结.doc


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蛋白质含量测定方法总结.doc
文档介绍:
蛋白质含量测定方法总结————————————————————————————————作者:————————————————————————————————日期: 实验七  蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多,目前常用的有染料法,双缩脲(Biuret)法,酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。[目的要求]1.掌握测定蛋白质的含量基本方法。2.了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法[实验原理]在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合,此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色,吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势,因为它操作简单,反应时间短,染料-蛋白质颜色稳定,抗干扰性强。本法的缺点是:对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质,有一定误差,因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的,故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。[器材]吸量管;试管;721型分光光度计[试剂]1.标准牛血清白蛋白溶液:配成0.1mg/ml的溶液。2.待测蛋白质溶液。3.染料溶液:称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml,再加入85%的浓磷酸100ml,用水稀释至1000ml,混匀备用。[操作步骤]1.  标准曲线的绘制:试剂(ml)\管号012345标准蛋白溶液00.20.40.60.81.0H2O1.00.80.60.40.20染料溶液5.05.05.05.05.05.0A595nm      按上表分别向各支试管内加入各种试剂,充分混匀,5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值(A)。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。2.样品测定:取1ml样品溶液(约含25~250微克蛋白质),加入染料溶液5ml混匀,5min后测定其595nm吸光度值,对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理]在碱性溶液中,双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰***基(—CO-NH2),或与此相似的基团[如—CH2-NH2,—CS-NH2,—C(NH)NH2]的任何化合物,无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连,均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—),可发生双缩脲反应,且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比,可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。[试剂]1.双缩脲试剂:取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解,再加2.5mol/L NaOH溶液300ml,KI 1.0g,然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现,即不能使用。2.标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10g/L的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。[器材] 1.试管:15×150mm 试管7只;     2.1ml,5ml移液管;3.坐标纸;                           4.721分光光度计。[操作步骤]     取试管7支,编号,按下表操作:试剂(ml)\管号空白管12345测定管蛋白标准液(10g/L)-0.10.20.30.40.5-生理盐水0.50.40.30.20.1-0.4待测样品------0.1双缩脲试剂3.03.03.03.03.03.03.0相当蛋白质(g/L)01020304050 混匀,37℃水浴20分钟,冷却至室温,在分光光度计波长540nm处,用空白管调零,读取各管吸光度值。1~5为标准曲线管,测得吸光度后,以吸光度为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。以测定管的吸光度,在标准曲线上求得蛋白质浓度。[注意事项]1.双缩脲试剂中,加入酒石酸钾钠,Cu2+形成稳定的络合铜离子,以防止CuSO4·5H20不稳定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸钾钠与CuSO4·5H20之比不低于3∶1,加入KI作为抗氧化试剂。2.双缩脲试剂要封闭贮存,防止 内容来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.