半薄超薄切片技术.ppt

半薄超薄切片技术背景:µ、双面刀刀刃的厚度可观察细胞的结构(最大有效倍数:1000)可观察细胞内的结构,分辨DNA、蛋白质等生物大分子、单个金属原子(放大倍数可达百万倍)观察半薄切片观察超薄切片半薄切片超薄切片?一、超薄切片技术介绍固定地好渗透包埋地好切地好载网膜做地好染地好超薄切片的基本要求:超薄切片主要步骤★取材★固定★漂洗、脱水★渗透、包埋★超薄切片★超薄切片染色每一步都是关键, (1)动作迅速,取材后快速放入固定液中;(2)体积要小,一般1㎜3,如果来不及,例如野外取材,也可将组织修成(1×1×2)mm大小长条形,之后再进行分割。(3)减小损伤,切割器械锋利,操作轻,避免牵拉、挫伤与挤压组织。(4)低温操作,最好在低温(0℃~4℃)下进行,降低酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。(5)取材部位要准确。。植物材料的取材可以先切成薄片,经适当固定后再切成小方块继续固定。2固定(抽气) 固定的目的︾采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定。︾目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态,牢固地固定在它们原来所在的位置上,不发生位移。︾良好的固定是获得精细结构的形态学图象的关键。(1)四氧化锇(OsO4)--OSMIUMTETRAOXIDE※强氧化剂,与氮原子有较强的亲和力,可较好的固定脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白;※固定变性DNA及核蛋白,不能固定天然DNA、RNA及糖原;※具有固定和电子染色双重作用,样品图象反差较好;▼酶的钝化剂,不适合细胞化学的固定;▼与乙醇/醛类反应生产沉淀--漂洗●分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,㎜;●固定时间一般为1-2小时,时间太长易使组织变脆,切片困难;●锇酸固定液常用浓度:1%-2%; 极易挥发,对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心!