鸡胚成纤维细胞培养doc.doc

一、鸡胚成纤维细胞的体外培养鸡胚成纤维细胞在病毒学研究中十分常用。孵化8-12d的鸡胚可用作培养的材料来源。(一):孵化10d的受精蛋数个。℃孵卵箱或恒温箱中,静置。每日翻动1—2次,以防止鸡胚粘连到蛋壳上影响发育。箱内湿度(40~70%)可通过在箱底放一盛水盘来维持。鸡胚的孵化期为2ld。孵化前,如遇蛋壳表面污物较多,可用刀片等器具刮除,不要用湿布擦拭,更不能用酒精棉球消毒或者用水洗蛋。孵育前可将受精蛋保存在10℃左右,保存期一般不超过10d。也有人将受精蛋保存在4℃冰箱中。:%胰蛋白酶、青霉素1001U/ml、链霉素100μg/ml混合消化液。用Hanks液或HEPES液配制。:DMEM培养液,添加10%-20%的胎牛血清(FCS)、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/mL。:手术器械、平皿、三角瓶或15ml血清瓶、离心管、100目不锈钢筛网、培养瓶或培养板、振荡水浴箱、离心机等。(二)操作步骤1)取孵化10d的鸡胚,分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒,晾干。用一已消毒金属器具将受精蛋大头端击破,用镊子小心夹去破碎蛋壳,然后撕去气室外面的膜,暴露出尿囊绒膜及附着的血管。开口大小以受精蛋内容物不溢出为宜,但不宜太小。用镊子轻轻夹住鸡胚的颈部,小心取出鸡胚,放于无菌培养皿中,除去头部、四肢、内脏和皮肤。2)胚体用Hanks液或生理盐水清洗3次,切成1-2mm3的小块,然后转移到容积适中的三角瓶或15ml血清瓶内。3)加入适量消化液,一般每10个鸡胚加20m1消化液,用胶塞密封瓶口。4)在振荡水浴箱上37℃慢速搅拌5-10min。加入少量血清钝化胰蛋白酶。然后通过100目不锈钢筛网,制备细胞悬液,将细胞悬液转移到离心管中。5)离心(800rpm,10min),弃上清液,将细胞沉淀用培养液洗2次。6)加入培养液,用吸管吹打制成细胞悬液。用血球计数板计数细胞。7)~1X06个细胞/ml的密度接种细胞。于37℃、5%CO2培养箱中培养。每2-3d换液1次。待细胞汇合成片后,可行传代培养。(三)结果在倒置显微镜下观察,用8~12d龄鸡胚培养的细胞主要为具有长突起的梭形、星形或三角形的成纤维细胞。用I型和Ⅲ型胶原的抗体作免疫细胞化学分析,培养物以呈阳性反应的成纤维细胞为主。(四)讨论鸡胚成纤维细胞在普通培养液中具有生长优势,一般不需特殊处理,经几次传代后就可逐渐排除其它细胞,得到较纯的成纤维细胞。体外培养的胚胎细胞的形态与所取鸡胚的胚龄有关。若用体节前期的胚胎,培养的细胞不是典型的长的或星形的成纤维细胞,而为宽扁的细胞,这可能与胚胎细胞的分化状态有关。二、传代培养(一)主要材料1)蛋白酶消化液:主要是用无Ca2+/Mg2+-%胰蛋白酶溶液,%的EDTA(或1mmol/L),~%或200IU/ml的胶原酶溶液或其它消化液。2)培养器皿:与原代培养时所用类型相同,所需数量须根据拟传代的规模而定。3)培养液及平衡盐溶液:同原代培养。(二)操作步骤传代培养的核心工作有两方面,一是分割培养物,二是再次接种。具体的操作步骤因原代培养的类型不同而有异。:1)