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原代内皮细胞的分离与培养.doc


文档分类:医学/心理学 | 页数:约14页 举报非法文档有奖
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.青霉素G(5000U/mL)+链霉素(5000μg/mL).(ECGS).。56°C,30min(seeNote1).(Table1).使用前加温到室温或37°C。建议分装到50-mL管,4°C储存,直至使用。避免重复加温和冷却。(Sigma).13mg/100mL溶解到无血清的DMEM/F-12,含青霉素和链霉素分别50U/mL和50μg/mL。-μmfilter过滤。应该现用现配。(Table2).-μmfilter过滤消毒。以10-mL分装入50-mL管,-20°C储存。使用前加40mL无菌去离子水稀释到1X。4°C保存可达到4周。(高压灭菌).。。。。。。。-μm滤膜。。-mL注射器。%明胶。,2%%明胶工作液10mL。-mL管。-mm组织培养板(Falcon).-Paque(Amersham).。需要容量的45%FBS、45%HUVEC培养基和10%二***亚砜(DMSO)混合,需要时现配。使用前必须是冰冷的。:兔抗人vWF)(Dako),羊抗人VE-cadherin(SantaCruz).%多聚甲醛(Fisher)。在通风橱内,加热到65°e,每100mLPBS溶解4g多聚甲醛。逐滴加入1MNaOH直至溶液变清。,S4°C储存。-conjugated乙酰化的LDL(AcLDL)(MolecularProbes).(光敏感)。用无血清的MCDB稀释成10μg/mL。(4',6-diamidino-2-phenyindole)(Sigma)(光敏感).水溶解成2mg/mL的储备液。储备液分装,-20°e储存。每10mLPBS溶解5μL储备液制成lμg/mL的工作液。工作液避光储存于4°C,最长2周。Table1PreparationofHUVECMediumDMEM/F-12       Tofinalvolumeof500mlTable2PreparationofTrypsinEDTA(5X)MethodsHUVEC的分离。下面的方法7-10d在100mm的培养皿融合成单细胞层。(seeNote2).1新鲜的脐静脉(lessthan24hold)置于无菌容器,储存于4°C直至使用。(seeNote3).2开始之前打开生物安全罩至少15min,喷洒70%酒精风干。3准备胶原酶溶液,预温至37°C。长13-20CM的脐带需要约25mL胶原酶溶液。4在生物安全罩内从容器取出脐带。70%酒精轻微浸泡纱布,包裹脐带的一端。轻轻捏住纱布擦拭脐带到另一端,清除表面血液和清除腔内的凝血块。(seeNote4).5将导管插入脐静脉的一端;6用尼龙线在适当位置固定导管。7连接双向开关到导管。8关闭双向阀。拔出注射器的活塞并把注射器连接到双向开关。25mLPBS充满注射器。插入活塞,打开双向阀并放脐带的开口端在大废物烧杯上。慢慢用PBS冲洗脐带。冲掉红细胞和小血凝块,直至洗出的液体变得清亮。(seeNote5).9关闭双向阀,分离注射器,拔出活塞,重新连接注射器到双向开关。不要在连接到注射器时拔出活塞,这样产生的真空就会把组织和血液吸入导管。用预温的胶原酶溶液充满注射器。(seeNote6)在插入活塞,打开双向阀。用胶原酶溶液冲洗掉脐带内的PBS。用止血钳夹紧脐带末端。慢慢用胶原酶充盈脐静脉。一旦脐静脉膨胀,关闭双向阀,轻轻搓揉脐带,使胶原酶分布均匀。室温放置30min。。建议:60-mm的培养皿3mL,100mm的7mL。在生物安全罩内,室温下静置20min。吸出明胶溶液并让参与溶液蒸发直至无液体残留。一旦表面干燥盖回盖子。(seeNote7).。(seeNote8).-mL管上。打开阀门,轻轻用剩余的胶原溶液冲出内皮细胞。,收集溶液在同一管内。,以4°C离心细胞悬液,300g,5min。,用无菌巴斯德吸管吸出上清,把小细胞粒留在管中。。。悬浮容量依赖于细胞粒

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  • 时间2019-11-10