实时荧光定量PCR检测的数据处置和结果报告专题培训课件.ppt

基本概念线性基线期(Linearbase-linephase)为PCR扩增的四个主要阶段之一(图)。线性基线期为扩增最初的10~15个循环,此时,PCR反应处于起始阶段,扩增产物很少,所产生的荧光信号很低,因此,基线荧光信号可根据此阶段产生的荧光信号来计算。基本概念指数期初期(Thebeginningofexponentialphase)为PCR扩增的四个主要阶段之一(图)。进入扩增指数期初期,荧光强度达到一个阈值,该阈值通常为基线荧光信号均值标准差的10倍。扩增达到阈值时的循环数可称为CT(ABIPrism有关文献)或CP(LightCycler有关文献)。CT或CP与原始扩增模板数量正负相关,可通其与原始模板的函数关系,来计算原始模板的数量。基本概念指数期(Exponentialphase)为PCR扩增的四个主要阶段之一(图)。PCR达到其最大的扩增阶段,理想条件下,每一循环后,PCR产物倍比增加。基本概念Ct值(thresholdcycle)或CP值(crossingpoint)Ct或CP值指的是实时监测扩增过程的荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。主要的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值,当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数(Ct)。有实验证明Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。Ct值是当前实时荧光PCR的主要定量参数。基本概念扩增效率E(amplificationefficiency)扩增效率指的是一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值,其值位于0到1之间。在PCR的前20或30个循环中,E值比较恒定,为指数扩增期,随后E值逐步降低,直至0,此时PCR达到平台期,不再扩增。扩增效率的计算可以采用系列稀释法,将稀释后浓度的对数值与所得Ct值做图,在一定范围内应该是得到一条直线,利用公式(1):E=10-1/K-1(K为该直线斜率)即可计算出E值。基本概念绝对定量(Absolutequantitation)绝对定量是使用一系列稀释的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定,根据系列浓度标准品的Ct值与起始模板(RNA或cDNA)量之间的线性比例关系,绘制标准曲线。待测标本的浓度则可根据其测定的Ct值,从标准曲线或回归方程计算得到原始模板的数量。这种方法是假定所有的标准品和临床标本有相近的扩增效率。系列稀释标准品的浓度应包含临床标本的浓度范围,并且在实时PCR仪及检测试剂方法的准确度和线性范围内。系列稀释的标准品最好是RNA,也可以是双链DN***段、单链DNA或载有靶序列的质粒。标准品必须是纯的,与RNA标准品相比,DNA有相对较好的稳定性、重复性和敏感性,但其与逆转录没有关系,不能反映逆转录效率。基本概念相对定量(Relativequantitation)在相对定量中,标本中特定mRNA的测定是建立在外标或参比样本(校准品)的基础上的。当使用校准品的时候,定量测定结果可表示为靶RNA/校准品比值。有多种数学模型可用来计算相对定量测定的平均正态化的基因表达。使用不同的数学模型所得到的结果和标准差均会有所差异。表5-1比较了不同的数据处理方法及其解释。基本概念标准品(Standard)用来构建标准曲线的已知浓度的样本。参比(Reference)用于对检测结果进行标准化的被动(Passive)或主动(Active)信号。如内标和外标即为主动性参比的例子。主动性参比意味着信号由PCR扩增所致,主动性参比有其自己的引物和探针。被动性参比则为非PCR所致,如ROX染料,可以校正荧光信号的非PCR波动。