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WB实验问题————————————————————————————————作者:————————————————————————————————日期: WesternBlot问题指南时间:2011-05-1308:55来源:网络作者:admin点击:3679次根据问题的类型主要分成以下几类(以下资料权作参考,请勿盲目模仿!);?解答:《抗体技术实验指南》和Antibodies(alaboratorymanual,根据问题的类型主要分成以下几类(以下资料权作参考,请勿盲目模仿!);?解答:《抗体技术实验指南》和Antibodies(alaboratorymanual,wrotebyEdHarlow,davidlane)两本书不错。(以下简写成WesternBlot),提取线粒体后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120μg,换了个santacloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?解答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查WesternBlot过程,提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSF就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。?解答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。,操作需要注意什么?解答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多,这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。E我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么办法可以解决?解答:你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,多加5-10%甲醇。,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作WesternBlot吗?解答:260kd的蛋白不好做,分离胶用6%,%。,要用什么方法来增加上样量?如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答:可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,。?解答:-80℃,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。,%,但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11%的配方,不知为何?解答:上述您提到的两种凝胶均可以使用,因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内,但需注意条带位置。,二抗是生物素化的多克隆抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5%的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗?解答:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,,一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?解答:WesternBlot一般上样30-100微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。要拿到好的结果,如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要反复地试了,当然有的不适合WesternBlot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。,处理样品有什么诀窍吗?还有,您用过大牛血清做封闭剂吗?浓度如何?效果是不是比BSA好一点?解答:必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制剂cocktail),封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体,使用BSA也是不错的选择。,在做western要注意什么呢?解答:做200kd蛋白的WesternBlot时要注意,分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做