第四组实验设计.doc

镉对小鼠肾脏的急性毒性作用实验设计(成员:余方琳、罗亚娟、王宝美、蔡陈华、蓝雪梅、王祥清)一、目的意义:1、观察***化镉(CdCl2)溶液灌胃染毒对小鼠的急性毒性。2、掌握外来化合物毒性实验的动物分组方法。3、了解镉对肾脏的损害情况、镉对肾脏的毒性机制。二、研究依据:镉(Cadmium,Cd)是一种银白色重金属,质地柔软,富有延展性,抗腐蚀、耐磨,是人体非必需元素,广泛并持久存在于工业与环境中,且有蓄积性,对肝脏和肾脏均有毒性作用,能诱导肝﹑肾等组织细胞的凋亡,肾脏是镉最重要的蓄积部位和靶器官,一般认为镉所致的肾损伤是不可逆的。镉所致的肾损伤是由在肝脏形成的镉金属硫蛋白(MT)复合物(Cd-MT)引起的。进入人体内的镉,在肝脏中诱导MT的合成并与之结合成Cd-MT,该复合物可通过血液运输到肾脏,经肾小球滤过后大部分被肾小管重吸收,通过胞饮作用,Cd-MT进入肾小管细胞溶酶体,在溶酶体中降解,分离并释放出游离镉产生毒性。一次注射Cd-MT主要造成肾小管细胞的坏死;而慢性镉污染造成的损伤可波及整个肾脏,包括肾单位主要的重吸收部分和滤过部分,而结构和功能的损害与食入剂量有明显的依赖关系。当肾小球滤过率下降到正常的50%以上时,血肌酐才开始迅速上升,因此当血肌酐明显高于正常时,常表示肾功能已严重损害。尿微量蛋白测定是近年来检测肾小球、肾小管功能的主要手段,主要包括检测IgG、TRf、ALB、NAG、α1-MG等,其中前3项主要反映肾小球功能,后2项反映肾小管受损情况。如IgG、ALB分别为大、中分子蛋白质,正常情况下绝大部分不能通过肾小球滤过膜屏障。当肾小球滤过屏障受损时,便出现ALB排出增加。当肾小球病变发展到一定程度时,IgG亦会在尿中出现。TRf分子质量直径大小与白蛋白接近,但带负电荷相对比白蛋白少。当肾小球基底膜的电荷屏障发生损害后、TRf比白蛋白更易漏出,所以TRf是一项更能反映肾小球滤过膜损害的灵敏指标,但尿中浓度相对比白蛋白低很多。小鼠肌酐ELISA试剂盒实验原理:用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。小鼠尿微量白蛋白(ALB)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠尿微量蛋白(ALB)水平。用纯化的小鼠尿微量蛋白(ALB)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入尿微量蛋白(ALB),再与HRP标记的ALB抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的尿微量蛋白(ALB)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中小鼠尿微量蛋白(ALB)浓度。三、实验仪器与试剂:1、***化镉(CdCl2、AR)、蒸馏水、%生理盐水2、小鼠肌酐ELISA试剂盒 (酶联板(Assayplate):一块(96孔)、标准品(Standard):2瓶(冻干品)、样品稀释液(SampleDiluent):1×20ml/瓶、生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibodyDiluent):1×10ml/瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 (HRP-avidinDiluent):1×10ml/瓶、生物素标记抗体(Biotin-antibody):1×120μl/瓶(1:100)、辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin):1×120μl/瓶(1:100)、底物溶液(TMBSubstrate):1×10ml/瓶、浓洗涤液(WashBuffer):1×20ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍、终止液(StopSolution):1×10ml/瓶(2NH2SO4))3、小鼠尿微量白蛋白酶联免疫分析盒(48孔配置96孔配置封板膜2片、酶标包被板1×481×96(2-8℃保存)、标准品540μg/××1瓶、××1瓶、酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶、样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶(2-8℃保存)、显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶、显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶、终止液3ml×1瓶6ml×1瓶、浓缩洗涤液20ml×20倍×1瓶20ml×30倍×1瓶)4、标准规格酶标仪、高速离心机、电热恒温培养箱、干净的试管、Eppendof管、系列可调节移液器及吸头、容量瓶、移液枪5、动物秤、灌胃针、毛细