草鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定.doc

草鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定        [11-01-2811:01:00]    编辑:studa20               作者:郝贵杰,沈锦玉,徐洋,姚嘉贇,潘晓艺【摘要】 目的:研制抗草鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体(mAb)并进行免疫学特性分析。方法:制备草鱼免疫球蛋白IgM,以其为抗原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,3~4次免疫后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA法对杂交瘤进行筛选,并鉴定mAb的生物学特性。结果:各株阳性克隆经3次亚克隆后,共获得5株抗草鱼IgM的mAbs,分别命名为4B3、2B11、4D5、3F2和4E6,它们的细胞上清ELISA效价为1∶3200~1∶6400,其中4D5的细胞上清及腹水效价分别为1∶6400和1∶256000,经亚类鉴定结果表明5株mAb均为IgG1。交叉反应结果表明5株mAb均不与台湾甲鱼、泰国甲鱼、日本甲鱼和中华鳖的血清反应,除mAb4B3外,其余4株均与草鱼、青鱼、鲢鱼、鳊鱼和花鱼骨的血清有明显的交叉反应,而与鲫鱼、鳗鱼的血清只有微弱的反应。mAb4B3只与草鱼和青鱼的血清有反应,而与其他鱼类血清反应很弱。免疫印迹实验结果表明mAb4D5能在变性条件下识别草鱼IgM的重链。ELISA检测mAb4D5对草鱼IgM的敏感性达10μg/L。结论:制备的抗草鱼IgMmAb可用于草鱼免疫球蛋白的结构分析、免疫应答水平监测和病原诊断等,具有广阔的应用前景。【关键词】 免疫球蛋白;间接ELISA;单克隆抗体;BALB/c小鼠草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是一种草食性鱼类,饲养成本低,养殖地域广,具有悠久的养殖历史,是我国四大家鱼之一,其养殖对我国农业经济增长具有重要的意义[1]。但草鱼病害一直困扰该产业的发展,尤其是草鱼出血病危害最为严重,常引起草鱼鱼种及成鱼的大批死亡。要解决这些问题,除了加强管理、提高养殖技术外,还必须重视其病原学、免疫学等领域的研究,将免疫预防手段引入到草鱼养殖业,通过免疫手段有效增强鱼体主动防御能力,减少疾病的发生机率[2]。然而对草鱼免疫学的研究还处于初始状态,王欣欣等[3]克隆并分析了草鱼免疫球蛋白分子重链cDNA的一些特性。李亚南[4]进行了嗜水产气单胞菌诱导的草鱼免疫球蛋白的分析,得出草鱼的免疫球蛋白主要是IgM,其单体的重链和轻链相对分子质量(Mr)分别为62000和26000。但未见到草鱼免疫球蛋白单克隆抗体(mAb)的研制和应用的报道。基于这种认识和生产上的需求,我们开展了草鱼免疫球蛋白mAb的研究,试图将mAb运用于草鱼Ig结构与功能的分析以及病原诊断学和免疫应答规律的研究。 1材料和方法 ~1500g,购自湖州某农贸市场。8周龄雌性BALB/c小鼠及ICR小鼠购自浙江大学医学院实验动物中心。HT、HAT及高糖型DMEM购自Sigma公司;小牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。L谷氨酰***(LG)购自上海实生细胞生物技术有限公司。辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自华美生物工程有限公司。融合用PEG4000购自Sigma公司,邻苯二***(OPD)购自华美公司,其他生化试剂均为国产分析纯试剂。 ,室温放置2h后,放入4℃冰箱过夜,使血清充