实验一、 半定量RT-PCR检测切割穹窿海马伞大鼠海马内.doc

实验一、半定量RT-PCR检测切割穹窿海马伞大鼠海马内Brn-4mRNA的表达变化本实验应用立体定位技术切割大鼠穹窿海马伞,取切割后1、3、7、14、21和28d海马组织和正常海马组织,制备提取液,然后应用半定量RT-PCR技术检测Brn-4mRNA的表达,与正常海马组织比较,观察切割后各时相点海马组织中Brn-4mRNA的表达变化。:健康成年SD大鼠,体重220~250g,雌雄不拘,由南通大学实验动物中心提供。:TrizolReagent(BBI公司)DEPC(SIGMA公司)逆转录试剂盒(MBI公司)TaqDNApolymerase(MBI公司)dNTPmix(MBI公司)DL-2000DNAMaker(TAKARA公司)琼脂糖(Pharmacia公司)溴化乙锭(SIGMA公司)Chlorpent复合麻醉剂:水合***,,戊巴比妥钠886mg,,,加ddH2O至100ml。(10)DEPC水:1000ml双蒸水中加入DEPC1ml,充分振荡,37℃孵育过夜,高压灭菌20min,4℃保存备用。(11)5×TBE:Tris54g,,,加ddH2O至1000ml。使用时1:×TBE工作液。(12)6×上样缓冲液:%甘油100ml,分装小管,4℃储存。(13)琼脂糖凝胶:根据待测DNA分子大小,选择适当浓度的琼脂糖浓度,×TBE缓冲液配置。(14)EB染液(10mg/ml):,加ddH2O至100ml,4℃避光保存。(15)5×甲醛凝胶电泳缓冲液:,,(),最后加DEPC处理水至溶液总体积为1L。(16)甲醛凝胶上样缓冲液:甲酰***,,5×,,,置-20℃保存。:恒温水浴锅(上海华联环境试验设备公司)低温冷冻离心机(德国Beckman公司)PCR仪(MJResearch公司)DYY—10型(ECP3000)三恒电泳仪(北京市六一仪器厂)捷达801系列形态学分析系统(江苏省捷达科技发展有限公司)蛋白核酸测定仪(Eppendorf公司)立体定位仪(上海江湾Ⅰ型C),随机分成7组,设其中1组为正常对照组,其余6组分别为穹窿海马伞切割手术后1、3、7、14、21和28d组,每组6只。~250gSD大鼠,。动物麻醉后,固定于立体定位仪上,颅顶部剪毛,碘酒和酒精消毒后,无菌条件下切开皮肤,分离颅骨外骨膜,显露前囟,记录前囟A(矢状轴)、L(冠状轴)、V(垂直轴)的坐标,参照Paxinos图谱确定双侧穹窿海马伞的切割范围,先在颅骨上确定右侧两点即①A1=A-、L1=L-1和②A2=A-、L2=L-4;左侧两点即③A3=A-、L3=L+1和④A4=A-