双光子激光扫描荧光显微镜及其应用.doc

实验技术双光子激光扫描荧光显微镜及其应用3陈德强夏安东1 王克逸1 黄文浩1(中国科学技术大学精密机械与精密仪器系合肥 230026))))、(TPLSM),共焦,三维TWOPHOTONLASERSCANNINGFLUORESCENCEMICROSCOPYANDITSAPPLICATIONSCHENDe2Qiang XIAAn2Dong Ke (DepartmentofPrecisionMachineryandInstrumentation,of, 230026)Abstract The-, two2photonlaserscanningfluorescencemicroscopy,confocal,three2dimension1 引言近年来,光学显微镜技术中的一个最引人注目的成就是双光子激发现象(two2photonexcitation,简称TPE)在共焦激光扫描显微镜(confocallaserscan2ningmicroscopy,简称CLSM)中的广泛应用[1].随着飞秒激光技术和光学显微镜技术的发展,现在人们已经能够比较容易地制造并使用双光子共焦激光扫描显微镜(two2photonlaserscanningmicroscopy,简称TPLSM),,双光子共焦激光扫描显微镜已成为半导体制造和检测、生物学、医学研究和三维高密度存储及其微细加工的重要工具,、 双光子激发原理简介在激光照射下,基态荧光分子或原子吸收一个光子后成为激发态,随后又弛豫到某一基态,,MariaGppert-Mayer预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中,同时吸收两个光子而成激发态,这种情况就是双光子激发过程[2].1961年,Kaiser等在CaF2∶Eu2+晶体中首次观察到了这种双光子激发现象[3].,NADH酶在350nm的光激发下产生450nm的荧光,而在双光子激发情形,,双光子技术可以使我们无需使用紫外光源3 国家自然科学基金和国家教委留学回国人员科研启动基金资助项目1999-06-04收到初稿,1999-08-27修回1) 中国科学技术大学理化中心选键化学实验室客座人员・232・,因而与单光子激发的线性过程相比,双光子激发就需要很强的激发光强,、,由于单光子激发的线性过程,在整个激发光路里的样品都由于激发而发出荧光,而对于双光子激发而言,,,在此基础上发展起来的三光子激发(荧光分子同时吸收3个光子)的LSM也越来越显示出其重要的特点,它具有比TPLSM更高的空间局域性[5]采用适当阶数的混沌理论可以对多光子吸收截面δ做一简单估算[5].显然,多光子激发要求两个或多个光子被分子同时吸收,“横截面积”-8—10-9cm的分子,典型的—10-,由测不准原理可虚拟中间态的持续时间ΔA值为10-16τ≈10-16s,因此,由A2Δτ得双光子激发吸估计Δ收截面δ大约为10-49cm4・s/,由A3(Δτ)2得三光子激发吸收截面δ大约为10-82cm6・s/,仅