酵母蔗糖酶的分离提取.doc

酵母蔗糖酶的分离提取作者:XX 指导老师:XX摘要:采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶,即在一定PH和适当的温度下,利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎再通过乙醇的分级与透析,得到纯化的酵母蔗糖酶。本实验也通过考马斯亮蓝G250染色法,测定蔗糖酶的活力和蛋白质浓度,对蔗糖酶的性质进行了研究。,%。关键词:蔗糖酶,分离提取,酶活力,蛋白质含量前言:蔗糖酶又称转化酶,可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。蔗糖酶在工业上用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,还用来制造含果糖和巧克力的软心糖等。蔗糖酶在畜牧方面,可防治禽兽的疾病,促进幼龄禽兽的发育,节约饲料和提高肉产量等;在农业方面可防治植物病害、刺激植物生长、提高作物产量;在工业上可用作鱼、肉、蔬菜和水果等食品的保鲜剂,同时也在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用,并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多,以甲苯自溶法最为常见。本实验采用自溶法从酵母中分离提纯蔗糖酶,通过测定得到的蔗糖酶的活力及蛋白质的含量。(实验室提供),醋酸钠(),乙酸乙酯(8ml),10%醋酸,无水乙醇,1mol/LNaOH,蒸馏水,PH=,DNS试剂,%NaCL,考马斯亮蓝G-250,系列标准蛋白液,150mol/L磷酸等。,722分光光度计,水浴锅,量筒25ml,烧杯100ml,大小试管若干,各种专用移液管,吸耳球,玻离棒,胶头滴管,PH试纸等。(1)自溶法 将5g酵母粉倒入500mL烧杯中、少量多次的加入15mL蒸馏水,搅拌均匀,、8mL乙酸乙酯,搅匀,盖好,于35℃恒温水浴中搅拌30min。(2)抽提 补加蒸馏水10mL,搅匀,盖好,于35℃恒温过夜,4000r/min离心10min,弃沉淀,得E1;量体积V1=,取出2mL置于4℃冰箱保存,待测酶活力及蛋白质浓度(留样1)。(3)乙醇分级和透析测E1pH:用10%(注意少量、慢加、搅匀,防止调过),%HAc;(a)第一次乙醇分级(30%乙醇饱和度):计算出使E1得乙醇浓度达30%,将E1和乙醇X1,放入冰浴中预冷,在不断搅拌下缓慢滴加乙醇,4000r/min离心10min,弃沉淀,留上清,得E2;量体积V2=(留样2);(b)第二次乙醇分级(50%乙醇饱和度)同上法加入X2(为达50%乙醇饱和度时需要补加的无水乙醇的体积),。4000r/min离心10min,弃上清,沉淀立即用10ml 150mol/,并装入透析袋,透析6小时,之后,4000r/min离心10min,得E3,量体积V3=(留样3);——考马斯亮蓝G250染色法(1)蛋白质标准曲线的制作表1 蛋白质定量测定标准曲线制作溶液0管1管2管3管4管5管留样1留样1’系列标准溶液蛋白/mL--