酵母蔗糖酶的提取及动力学研究.doc

酵母蔗糖酶的提取及动力学研究实验目的:提取酵母蔗糖酶,并逐步纯化、鉴定;根据酵母蔗糖酶的特性,进行每一步纯化过程后蛋白含量和酶活力测定;纯化后的酵母蔗糖酶进行最适pH、最适温度、激活剂、抑剂制、一定条件下最大反应速度和Km值的确定;熟悉操作过程;掌握实验方法;明确实验原理。实验要求:能够根据实验目的进行整个实验过程的设计与操作,如酶的提取、PAGE胶的确定与制备、测定出各步蛋白质含量、酶活力,确定出一定条件下最大反应速度和Km值。总结本实验成功与失败的原因等。,有些需学生自己配制所需的试剂。,如分光光度仪、水浴锅、高速冷冻离心机、研钵、平板电泳槽;电泳仪;微量进液器等。本实验属综合设计性实验,接近研究性实验,包括八个连续的实验内容:蔗糖酶的提取与部分纯化;离子交换柱层析纯化蔗糖酶;蔗糖酶活性及蛋白质含量的测定;pH对酶活性的影响和最适pH的测定;温度对酶活性的影响和最适温度的测定;蔗糖酶Km值测定及脲素的抑制作用;蔗糖酶纯度测定;SDS聚丙烯酰***凝胶电泳测定蔗糖酶相对分子质量。该项目所需要掌握的原理、方法、技术多样化,并且多个知识点互相联系,实验内容逐步加深,构成了一个综合性整体。酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验为学生提供一个较全面的实践机会,学****如何提取纯化、分析鉴定一种酶,并对这种酶的性质,尤其是动力学性质作初步的研究。使学生熟悉有关生物技术的基本操作。ycesCerevisiae中发现了蔗糖酶以来,它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶(invertase)(,—D—呋喃果糖苷果糖水解酶)(fructofuranosidefructohydrolase)()特异地催化非还原糖中的,—呋喃果糖苷键水解,具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖水解,生成密二糖和果糖。啤酒酵母中蔗糖酶含量丰富。该酶以两种形式(表1)存在于酵母细胞膜的外侧和内侧,在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶(externalyeastinvertase),其活力占蔗糖酶活力的大部分,是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶(internalyeastinvertase),含有少量的糖。本实验提取纯化的主要是外酶。表1两种酶的性质对照糖含底物为蔗底物为棉等电稳定pH最适亚基最适pHW名称M量糖的K子糖的K点pI范围温度mm27万外酶50%(~)~?(22万)<3%(~)~:等电点、盐析、有机溶剂沉淀、加热、离子交换层析等。蛋白质含量的测定方法:酶活力、比活力、纯化倍数:最适温度、最适pH、激活剂、抑剂制。Km值及确定:(一)实验目的学****酶的提取和纯化方法,掌握各步骤的实验原理,并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。(二)实验原理(略)(三)实验仪器、、高速冷冻离心机、恒温水浴箱、-20?、研钵、(50ml或100ml)、移液器(1000ul)(低温保存)(海沙)(使用前预冷到0?以下)、95%乙醇、去离子水(使用前冷至4?左右)、Tris-HCl()缓冲液(四)(1)将研钵稳妥放入冰浴中。(2)称取30g鲜啤酒酵母,加20g石英砂放入研钵中,加30ml甲苯(边研边加),在研钵内研磨成糊状,然后每次缓慢加入预冷的10ml去离子水,边加边研磨以便将蔗糖酶充分转入水相。共加水50ml去离子水,研磨约60分钟,使其成糊状液体。研磨时可用显微镜检查研磨的效果,至酵母细胞大部分研碎。(3)将混合物转入的离心管中,平衡后,用高速冷冻离心机离心,4?,15000rpm,15min。如果中间白色的脂肪层厚,说明研磨效果良好。用移液器(或滴管)吸出上层有机相。(4)用移液器小心地取出脂肪层下面的水相,转入清洁的离心管中,4?,15000rpm,离心15min。(5)将水相液转入量筒,量出体积(粗级分I),留出2ml,-20?下保存,用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。(1)将盛有粗级分I的小烧杯稳妥地放入50?水浴中,用玻璃棒温和搅动,保温30分钟。(2)取出小烧杯,迅速用冰浴冷却,转入清洁的离心管中,用4?,15000rpm,离心15min,(3)将上清液转入量筒,量出体积(热级分II),留出2ml,-20?下保存,测定酶活力及蛋白质含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。(1)将