人血小板衍生生长因子B链成熟肽基因克隆及其表达.pdf

中英文对照缩略词表英文缩写英文全名中文译名PDGFAmpKallDEPCDNAdNTPDTTEBEDTAFCMKDLBmRNAMTToDPCRRNArpmRT,PCRSDSTAETBETEMEDIPTGplatelet-etraacedcacidflowcytometrykilodaltonLuria—Bel'tanlmediummessageRNA3(4,5dimethythiazol一2y1)一2,5一diphenytroliumbromideopticaldensitypolymerasechahareactionRibonucleicacid,-tetramethyleukylenediamineisopropylthio—p-D-galactoside血小板衍生生长因子氨苄青霉素卡那霉索焦碳酸二乙酯脱氧核糖核酸脱氧三磷酸核苷二硫苏糖醇溴化乙啶乙二******乙二***异丙基硫代一B—D一半乳糖苷OBosteoblast成骨细胞人血小板衍生生长因子B链成熟肽基因克隆及表达摘要研究背景/目的复杂骨折、骨不连、骨缺损、骨质疏松等一直是困扰骨科界的难题。骨折愈合期延长,易招致各种并发症,而骨不连、骨缺损目前临床上尚无有效治疗方法。除了组织工程,近年研究热点主要集中在骨组织的代谢调节方面,包括各种生长因子的调节以及细胞间信号传导的调控等。血小板衍生生长因子(PDGF)作为一族多肽生长因子,存在于人体多种组织,在骨骼、心脏等重要组织器官的病理、生理过程中发挥着重要作用。PDGF直接或通过与其他生长因子的协同作用,调节成骨一破骨细胞之间的功能性平衡,加快骨折愈合和其他骨病损伤修复。如能实现和骨生物材料有机结合,有望使无创治疗代替有创手术,从而使此类患者减轻痛苦,缩短疗程。PDGF家族所有亚型中,,也是最早获准应用于临床的一种生长因子,但目前仅限于难治性创伤(如糖尿病人的褥疮)等的治疗。本研究通过分子克隆方法获取人血小板衍生生长因子B链成熟肽基因,构建原核表达载体;利用大肠杆菌体系原核表达人血小板衍生生长因子B链前体蛋白,并纯化、复性进而获得具有功能活性的PDGF—BB;并对获得的重组rhPDGF—BB蛋白进行体外功能活性鉴定,同时,初步探讨PDGF—BB在毕赤酵母中的表达,为寻找更优化的表达纯化方法提供实验学依据。通过上述研究,为PDGF—BB在骨修复与重建及创伤愈合等方面的进一步功能研究奠定基础。方法(1)原代培养人脐静脉内皮细胞,收集细胞沉淀,提取脐静脉内皮细胞总RNA;(2)以血管内皮细胞总RNA为逆转录模板,应用一步法RT—PCR进行扩增,获得PDGF—B。-PCR产物为模板,利用特异引物进行PCR扩增,:(3);之后与表达质粒pQE一30连接,构建表达载体pQE30—PDGF—Bl,双酶切及PCR鉴定;(4),IPTG、37。C诱导表达,15%***凝胶电泳分析蛋白的表达情况。(5)Wsetem—Blot分析表达的重组蛋白的免疫原性;(6)重组蛋白的纯化与复性。大量诱导培养表达菌M15,裂解细菌,洗涤并裂解包涵体,N—NTA亲和层析纯化复性PDGF—B。纯化后的单体蛋白应用谷胱甘肽还原缓冲体系进行复性,SDS-PAGE分析。(7)重组蛋白体外生物学活性鉴定。体外原代培养SD大鼠成骨细胞,应用rhPDGF—BB对培养中的细胞进行干预,MTT检测rhPDGF—BB对小鼠成骨细胞增殖活性的影响,流式细胞术(FCM)检测rhPDGF—BB刺激作用下对大鼠成骨细胞增殖的影响。(8)真核(毕赤酵母)表达载体构建及鉴定。以编码区eDNA为模板,利用两对特异引物进行PCR扩增,;分别与酵母表达载体连接,构建PDGF—B的重组表达型质粒载体pMETB—PDGFB2,pMETⅡA—PDGFB3。结果(1)RT—PCR扩增产物电泳以血管内皮细胞总RNA为模板,非特异扩增出编码区eDNA,1%琼脂糖电泳图上在700bp左右见一特异条带(721bp);,利用特异引物PCR扩增出PDGFB成熟肽片段。PCR结果电泳在